急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌实时荧光RPA快速检测方法的建立.pdf

63-07ChineseVeterinaryScience网络首发时间：2 0 2 3-0 9-2 82024,54(01):63-69中国兽医科学D0I:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0004中图分类号：S852.613文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 9 6（2 0 2 4)0 1-0 0急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌实时荧光RPA快速检测方法的建立田飞焱12,孟霞1,裴建明1,黄海莉1,徐节华1,顾泽茂,王淑兵4,吴葵*（1.江西省农业技术推广中心，江西西南昌330 0 46；2.华中农业大学水产学院，湖北武汉430070;3.南昌市疾病预防控制中心，江西南昌330038;4.南昌市新建区动物疫病预防控制中心，江西南昌330100)摘要：为建立一种简单、快速的急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌（VpAHPND）检测方法，本研究根据pirB基因保守序列设计了多组引物和exo探针组合，经过筛选优化，建立了VpAHPND实时荧光RPA检测方法。结果显示，该方法在42 恒温反应15min即可快速、特异性地检测出急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌（VpAHPND），与其他虾类病原和养殖环境中的致病菌不发生交叉反应，最低菌体细胞检出浓度为3.8 X102CFU/mL，质粒检测限为1.17 X10copies/uL，且具有良好的重复性。利用本研究建立的实时荧光RPA方法与WOAH推荐的实时荧光qPCR方法对50 份人工感染的南美白对虾样品进行检测，二者检测结果一致。结果表明，本研究建立的检测方法操作简单，反应灵敏，仪器依赖性低，结果可靠，适用于实验室和现场对VpAHPND快速检测。关键词：急性肝胰腺坏死病；副溶血弧菌；重组酶聚合酶等温扩增技术；快速检测Establishment of a real-time RPA method for rapid detection of Vibrioparahaemolyticus causing acute hepatopancreas necrosis diseaseTIAN Feiyan-2,MENG Xia,PEI Jianming,HUANG Haili,XU Jiehua,GU Zemao,WANG Shubing,WU Kui3*(1.Jiangxi Provincial Centerfor A gricultural Technical Extension,Nanchang 330046,China;2.College of Fisheries,Huazhong A gricultural University,Wuhan 430070,China;3.Nanchang Center for Disease Control and Prevention,Nanchang330038,China;4.Xinjian Center for Animal Disease Control and Prevention,Nanchang 330100,China)Abstract:To establish a simple and rapid method for the detection of AHPND-causing Vibrio para-haemolyticus(Vpnrp),multiple pairs of primers and exo-probe were designed according to the conserved regionof pirB gene,a real-time recombinase polymerase amplification(RPA)method was developed throughscreening the primers,exo-probes and optimizing experimental conditions.The method can be completedwithin 15 min at 42 C,VpAIPND detected quickly and specifically,and has no cross reaction with othershrimp pathogens and pathogenic bacteria in the breeding environment,the minimum detectable cell con-centration of VpArPND was 3.8 X102 CFU/mL,plasmid detection limit was 1.17 X10 copies/L,and the re-peatability was good.A total of 50 Litopenaeus vannamei samples of artificial infection were tested bythe established RPA method and the test results were consistent with the wOAH recommended real-timeqPCR.These results showed that the real-time RPA method developed in this study was a simple,sensi-tive,low instrument dependence and reliable method which could potentially be applied for the rapid收稿日期：2 0 2 3-0 6-19；修回日期：2 0 2 3-0 9-16基金项目：江西省重点研发计划项目（2 0 2 0 2 BBG73031）；江西省农牧渔业科研指导性课题项目【赣农厅办函（2 0 2 1)36 号-序号2 9作者简介：田飞焱（198 2-），男，湖北浠水人，高级水产师，博士生，主要从事水生动物疾病预防控制工作，Tel:[phone]，E-mail：c q-h b-t i a n 16 3.c o m。*通讯作者：吴葵（198 5-），男，江西高安人，副主任技师，博士，主要从事人类疾病预防控制工作,E-mail:。64第54卷中国兽医科学detection of VpArPNp in the research laboratory and on site diagnosis.Key words:acute hepatopancreas necrosis disease;Vibrio parahaemolyticus;recombinase polymeraseamplification;rapiddetection*Corresponding author:WU Kui,E-mail:急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreas necrosisdisease，A H PND）是严重危害斑节对虾（Penaeusmonodon）、南美白对虾（Litopenaeus vannamei)和中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）等虾类的水生动物疾病,该病在感染早期时肝胰腺萎缩、发白，之后出现黑色斑点或条纹，空肠空胃，甲壳变软，因绝大部分垂死的虾沉人水底，不易被发现，也被称为“偷死病”。自2 0 0 9年,AHPND已在我国、东南亚地区以及墨西哥、拉丁美洲等地广泛暴发流行，导致虾类死亡率极高。研究证实，该病是由携带有能编码pirA和pirB蛋白的pVA1质粒（7 0 kb)的副溶血弧菌特定毒力株(AHPND-causing Vibrio parahaemo-lyticus,VpAHPND)引起2-3,pirA和pirB毒素蛋白与一种杀虫蛋白Cry相似,具有穿孔活性，当pirA和pirB毒素蛋白分泌到细胞外环境时，会对感染宿主造成损害4-5。其中,pirB毒素主要决定该菌的致病力,pirA毒力相对较弱6 。近年来的研究表明,pVA1质粒可能在不同弧菌间转移，已报道的携带有pVA1质粒的弧菌种类包括副溶血弧菌、哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）欧文氏弧菌（Vibrioowensi）和坎贝氏弧菌（Vi b r i o c a mp b e l l i),表明该病呈现了病原的多样性7 。研究开发AHPND的防控技术对虾类健康养殖具有重要意义，建立高效、灵敏的AHPND病原检测方法是有效防控该病的手段之一，目前对副溶血弧菌特定毒力株（VpAHPND）的检测方法主要包括聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）、套式PCR6、实时荧光quantitativePCR(qPCR）8-9 和环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal ampli-fication,LAMP)101等。重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)虽起步较晚，但其加热条件要求低，反应过程简单，反应时间短，灵敏度高，特异性强，已发展成为替代PCR的检测方法之一1,该方法是通过重组酶同引物结合形成复合体，在DNA双链中寻找靶序列，一旦找到了靶序列，DNA双链打开并启动合成，被替换的单链结构与单链DNA结合蛋白结合，然后重组酶与引物分离,DNA聚合酶与引物结合，使引物得到延伸，循环重复使目标序列呈现指数级扩增，通常RPA在37 42 的温度范围内反应2 0 min左右即可得到可检出的扩增产物12-13。鉴于现有方法对实验设备的依赖性，本研究拟针对副溶血弧菌特定毒力株(VpAHPND)所携带的pVA1质粒的pirB基因设计引物和探针，结合小巧易携带的恒温荧光扩增仪，建立特异、灵敏且适用于养殖现场的实时荧光RPA快速检测方法，并通过感染试验模拟的临床样品进行验证，以期为AHPND的防控提供新的技术支撑。1材料与方法1.1供试菌株与临床样品副溶血弧菌VpAFPND-65毒力株由笔者所在实验室分离、鉴定并保存。副溶血弧菌RIMD2210633株、霍乱弧菌（Vibriocholera,Vc)175株、志贺氏菌（Shigellacastellani,Sc）CM CC5157 2 株、沙门菌（Salmonellaenterica,Se)H9812株由南昌市疾病预防控制中心菌种库提供。白斑综合征病毒（white spot syndromevirus,WSSV）、十足目虹彩病毒（decapod iridescentvirus1,DIV1）、传染性皮下和造血器官坏死病病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosisvirus,IHHNV）和虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hep-atopenaei,EHP)的阳性组织由笔者所在实验室收集、鉴定并保存。南美白对虾采购自南昌市水产批发市场。1.2主要试剂与仪器TAKARAProbe qPCRMix、T A K A RA 细菌基因组DNA提取试剂盒为宝日医生物技术（北京）有限公司产品。DNeasyBlood&TissueKit为Qiagen公司产品。3%氯化钠碱性蛋白陈水、TCBS琼脂培养基、营养肉汤培养基为北京路桥技术股份有限公司产品。TwistAmpexoKit、T 16-ISO 恒温荧光扩增仪为英国Twista公司产品。Mastercler?Eprealplex4S荧光定量PCR仪为Eppendorf公司产品。1.3重组质粒标准品的构建选用登录号为MH718270.1的PirA/B基因序列（片段长度为196 1bp），委托生工生物工程（上海）股份有限公司构建并合成重组质粒标准品pUC57-PirA/B，按DNA拷贝数计算公式，得出试验所用质粒标准品拷贝数为1.17 10 1copies/L，将构建的质粒标准品做10 倍梯度稀释，一2 0 保存备用1.4样品DNA的提取分别将1.1项中各菌株用接种针挑取少量菌接65田飞焱等：性肝胰腺坏死病副溶血弧菌实时荧光RPA快速检测方法的建立第1期种于3%氯化钠碱性蛋白陈水或营养肉汤中，36 摇床过夜培养后各取1mL菌液，使用TAKARA细菌基因组DNA提取试剂盒，按说明书方法提取细菌基因组DNA,定容体积为10 0 L，一2 0 保存备用。同时将VpAHPND-65毒力株的过夜培养菌液按10倍梯度稀释，各取10 0 L稀释菌液涂布于TCBS平板，36 培养2 4h后进行菌落计数，经计算，过夜培养后的VpAHPND-65菌液的菌体细胞浓度为3.8 10 8CFU/mL。W SSV、IH H NV、D IV1、EH P等DNA是通过使用QiagenDNeasyBlood&TissueKit从相应阳性组织中提取获得1.5引物探针设计对GenBank中登录的PirB基因序列进行分析比对，依据RPA引物、exo探针的设计原则，设计了3组引物及其exo探针（表1），委托生工生物工程（上海)股份有限公司合成。以浓度为1.17 10 4copies/L的pUC57-PirA/B质粒标准品为模板，使用便携式T16-ISO恒温扩增仪进行扩增，收集FAM荧光，筛选最佳引物和exo探针组合。表1RPA引物及eXO探针序列Table 1Sequence of RPA primers and exo probes组别引物名称引物序列（5 3）GroupsPrimernamePrimersequencesPirB-RPA-F1ATGAAGTGATGGGTGCTCGTAGTTGGTGTA1组Group1PirB-RPA-R1CGCCGTTTAACTCAATAGATTGGTAATGCTCPirB-RPA-P1ACTATATTGCTACAGGTACGGAAGATGAAA FAM-dTATHFCBHQ1-dTCAACCATTAAAACCA-PPirB-RPA-F2TGATGAAGTGATGGGTGCTCGTAGTTGGTG2组Group2PirB-RPA-R2CGCCGTTTAACTCAATAGATTGGTAATGCTCPirB-RPA-P2TAAAAATTGAATCATGGAACAGTATTGAAAFAM-dTATHFABHQ1-dTTATTACAATCGCGTA-PPirB-RPA-F3ATGAAGTGATGGGTGCTCGTAGTTGGTGTA3组Group3PirB-RPA-R3GTAAGCGCCGTTTAACTCAATAGATTGGTAPirB-RPA-P3TCACAGTAATTTAATTTCATATTCACCTGCFAM-dTTHFBH Q 1-d T T G G T T T T CCT A G T G G-P1.6反应条件的优化将1.5项筛选的引物和exo探针浓度分别稀释成2 0 mol/L、10 mol/L和5mol/L,依照 TwistAmpexoKit说明书中各试剂配比配制50 L反应体系，筛选最佳引物、exo探针浓度。引物、exo探针浓度确定后，使用不同浓度的质粒标准品为模板，在不同温度条件下（37、39、40、42）扩增2 0 min后，以确定最佳反应温度。以最佳的引物和exo探针浓度、反应温度进行后续试验1.7特异性试验以1.4项提取的VpAHPND-65毒力株、副溶血弧菌RIMD2210633株、霍乱弧菌Vc-175株、志贺氏菌CMCC51572株、沙门菌H9812株及WSSV、IH H NV、DIV1、EH P的DNA为模板，以健康虾类组织DNA为阴性对照、ddH,O为空白对照，应用优化的VpAND实时荧光RPA方法进行检测，验证该方法是否与上述病原微生物存在交叉反应1.8敏感性试验1.8.1质粒检测限分析选取1.3项中浓度为1.17 10 6copies/L1.17 10 c o p i e s/L 的 pUC57-PirA/B质粒标准品作为模板，同时使用建立的VpAHPND实时荧光RPA方法和世界动物卫生组织（WOAH)推荐的实时荧光qPCR方法8 进行比对试验，重复3次，测定本方法所能检测的最低质粒拷贝数1.8.22基因组灵敏度分析将1.4项提取的VpAHFND-65毒力株DNA原液进行10 倍梯度稀释，以DNA原液及稀释液作为模板，ddH,O为阴性对照,同时使用建立的VpAHPND实时荧光RPA方法及WOAH推荐的实时荧光qPCR8对该梯度稀释液进行检测,重复3次，测定其所能检测的最低菌体细胞浓度1.9重复性试验以 1.17 10 copies/L、1.17 X10 4 c o p i e s/L这2 个浓度的pUC57-PirA/B质粒标准品进行重复性验证，每组设置3个组内重复1.10模拟感染样品的检测模拟感染试验前对购自南昌市水产批发市场的一批南美白对虾随机抽取2 5尾，取其肝胰腺组织按前述方法进行核酸抽提和qPCR检测，确定试验样本为VpAHFND阴性样本。然后以菌体细胞浓度为1.1710CFU/mL的VpAHPND-65株菌悬液对剩余的50 尾虾进行浸泡感染，浸泡感染1h后转人玻璃水缸中养殖。发现有活动异常或濒临死亡的虾，按无菌操作的方法取肝胰腺组织,加人1：1(W/V)的无菌生理盐水研磨匀浆后提取总DNA。用建立的66第54卷中国兽医科学VpAHPND实时荧光RPA检测方法和WOAH推荐的实时荧光qPCR方法8 进行平行检测，并对检测结果进行比较。2结果2.1引物的筛选以浓度为1.17 X104copies/L的pUC57-PirA/B质粒标准品为模板，用设计的3组引物和exo探针组合进行RPA扩增，结果显示，3组引物和探针组合均有一定强度的荧光信号产生，在起始扩增时，Group2、3的荧光强度值较低；其中,Group2起峰时间最早，15min内荧光强度即达到了最大值，荧光强度增值最大，等温扩增效率最高（图1)。故选择Group2组合用于后续试验。4.500400035003.0002.500200015001000GfoupGroup2500Group3310560+120+18+240+360+420480+540+600+60+720+780+840900+960+1020+1080+1140+1200+1260时间/sTime图13组引物和exo探针组合的扩增效果Figure 1 The real-time RPA results of the 3 primer and exoprobe sets2.2反应条件的优化用矩阵法进行引物和exo探针浓度筛选，结果显示，当引物和exo探针浓度均为10 mol/L时，扩增效率最佳，将此浓度确定为引物和exo探针最佳搭配浓度；反应温度筛选试验结果显示，当反应温度为42 时，起峰时间最早，荧光信号值最强（结果未展示）。因此确定的最佳反应体系与条件：无引物再水合缓冲液2 9.5L,浓度为10 mol/L的引物PirB-RPA-F2和PirB-RPA-R2各2.1L,10mol/L的探针PirB-RPA-P20.6L,模板5L，用ddH,O补齐至47.5L，涡旋混匀。将上述预混液加人到装有冻干酶粉的反应管中，用移液枪吹打混匀，最后将2.5L的醋酸镁（2 8 0 mmol/L）加到反应管盖上，盖上管盖后立即离心涡旋混匀，迅速置于已设置好的T16-ISO恒温扩增仪中,42 反应2 0 min。2.3特异性试验以1.4项提取的VpAHPND-65毒力株、副溶血弧菌RIMD2210633株、霍乱弧菌Vc-175株、志贺氏菌CMCC51572株、沙门菌H9812株及虾类主要病原WSSV、I H H NV、D I V1、EH P的DNA为模板，用建立的实时荧光RPA方法进行检测，结果显示，只有VpAHFND-65毒力株出现特异性扩增曲线，其他病原及阴性、空白对照均无扩增（图2），表明建立的VpAHFND实时荧光RPA方法具有良好的特异性。50004.50040003.500300022.5002.00015001000500-1104:24:29+60+120+180+240+300+360+420+480+540+600+660+720+780+840+900+960+1020+1080+1140+1200+1260时间/sTime图2VpAHPND实时荧光RPA的特异性分析Figure 2 Specificity test of the VparND real-time RPA method1:VpNHND-65毒力株；2：副溶血弧菌RIMD2210633株；3：霍乱弧菌Vc-175株；4：志贺氏菌CMCC51572株；5：沙门菌H9812株；6：WSSV；7:EH P；8:D I V1;9:I H H NV；10 阴性对照；11:空白对照1:VpAHPND-65;2:Vp-RIMD2210633;3:Vc-175;4:Sc-CMCC51572;5:Se-H9812;6:WSSV;7:EHP;8:DIV1;9:IHHNV;10:Negative con-trol;1l:Blank control.2.4敏感性试验2.4.1质粒检测限分析选取浓度为1.17 10 6copies/L1.17 X10 c o p i e s/L的 pUC57-PirA/B质粒标准品作为模板，进行实时荧光RPA和qPCR比对检测。结果显示，实时荧光RPA和qPCR检测到的最低质粒浓度均为1.17 10 copies/L（图3、4),灵敏度相当，表明建立的RPA方法具有较高的敏感性。50004500400035003.00025002.00015001.0005007-804:32:24+60+120+180+240+300+360+420+480+540+600+660+720+780+840+900+960+1020+1080+1140+1200+1260时间/sTime图3VPAHPND实时荧光RPA法质粒灵敏度分析Figure 3 Plasmid sensitivity test of the VparND real-time RPAmethod17:pUC57-PirA/B浓度分别为1.17 10 1.17 10 copies/L;8：空白对照。1-7:Adilutionrangefrom1.17X10%to1.17X10copies/LofpUC57-PirA/BDNA;8:Blank control.2.4.2基因组灵敏度分析以菌体细胞浓度为3.8X1083.810CFU/mL的VpAHPND-65基因组67田飞焱等：急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌实时荧光RPA快速检测方法的建立第1期28700234150020105678021013141516171819202122232425262728293031323334353637383940循环数Cyclenumber图4VPATPND实时荧光qPCR法质粒灵敏度分析Figure 4Plasmid sensitivity test of the VpAPND real-timeqPCR method17:pUC57-PirA/B浓度分别为1.17 10 6 1.17 10 copies/L;8：空白对照。17:A dilution range from 1.17 X106 to 1.17 X10 copies/L ofpUC57-PirA/B DNA;8:Blank control.DNA为模板，分别进行实时荧光RPA和qPCR比对检测。结果(图5、6)显示,当以细菌基因组DNA为模板，实时荧光RPA和PCR方法所能检测的最低菌体细胞浓度均为3.8 X102CFU/mL，表明建立的实时荧光RPA方法与WOAH推荐的实时荧光qPCR方法的灵敏度相当，均处于同一数量级。但实时荧光RPA方法在3min左右可观察到扩增曲线，检测时间只需要15min左右，而实时荧光qPCR则需1h左右，可见实时荧光RPA检测方法更为高效。45004.0003.50053.0002.5002.000150010005009-100352:53+60+120+180+240+300+360+420+480+540+600+660+720+780+840+900+960+1020+1080+1140+1200+1260时间/sTime图5VPAHFND实时荧光RPA法基因组灵敏度分析Figure 5Genome sensitivity test of the VpaHPND real-timeRPA method19:基因组浓度分别为3.8 10 8 3.8 10 CFU/mL;10：空白对照19:A dilution range from 3.8 X 103.8 X 10CFU/mL of VpArND ge-nomic DNA;1o:Blank control.2.5重复性试验选取浓度为1.17 10 copies/L、1.17 10 4copies/L的质粒标准品为模板进行重复性验证。结果显示，相同浓度的模板检测结果一致，扩增曲线差异较小(图7)。表明建立的VpAHPND实时荧光RPA方法重复性好。25002400230022002100200019001800170016001500140013001200110031000900800700600500400300200810009-10-1000111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940循环数Cyclenumber图6VpAPND实时荧光qPCR法基因组灵敏度试验Figure 6 Genome sensitivity test of the VpArPND real-timeqPCR method19：基因组浓度分别为3.8 10 8 3.8 10 CFU/mL；10：空白对照。19:A dilution range from 3.8 X 1083.8 X 10 CFU/mL of VpAiFND ge-nomic DNA;10:Blank control.50004.5004.0003.50030001-32.5004-62.00015001000500701038:04+60+120+180+240+300+360+420+480+540+600+660+720+780+840+900+960+1020+1080+1140+1200+1260时间/sTime图7VPAHPND实时荧光RPA重复性试验Figure 7 Repeatability of the VparND real-time RAA method13：浓度为1.17 10 copies/L;46:浓度为1.17 10 copies/L7：空白对照。13:Dilution were 1.17X10copies/L;46:Dilution were1.17X104copies/L;7:Blank control.2.6模拟感染样品的检测应用本研究建立的VpAHPND实时荧光RPA方法和WOAH推荐的实时荧光PCR方法8 对50 份人工感染的南美白对虾样品提取肝胰腺组织DNA后进行检测，实时荧光RPA的检测结果：8 份样品为VpAHPND阴性，42 份样品为VpAHPND阳性，与实时荧光qPCR检测结果一致,且检测为阳性的南美白对虾具有典型的早期肝胰腺坏死的临床病症。表明建立的VPAHPND实时荧光RPA方法准确性较高，可靠性强，可用于对AHPND临床样品的检测3讨论2009年以来，AHPND的大面积暴发流行导致全球对虾产量急剧下降，给亚洲养虾业带来了严重的经济损失，我国以南美白对虾养殖为主的虾类养殖业亦受到冲击。目前对AHPND的防控还未形成一套科学有效的完整体系，监测VPAHPND感染携带情况是控制AHPND流行的重点策略，因此开发能68第54卷中国兽医科学应用于生产的简易、快速的疾病病原检测方法尤为迫切 。引发AHPND的是副溶血弧菌中一类携带pVA1质粒的特定毒力株，仅通过病原菌的分离培养鉴定无法将其区分，需采用分子生物学方法对携带的pVA1质粒进行检测验证。目前广泛应用的分子生物学方法包括PCR、套式PCR、荧光PCR、LAMP等，如Han等8 和童桂香等9 分别根据pVA1质粒中pirA基因保守序列建立的实时荧光qPCR方法和TaqMan-MGB探针实时荧光qPCR方法，灵敏度均达到了10 copies/反应。但这些PCR及其衍生方法对仪器依赖程度高，检测时间较长，不适于养殖场现场检测。近些年,RPA等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器，能够快速、准确的进行病原检测而作为PCR、LA M P等方法的替代方案得到广泛关注，如林彦星等14 根据非洲猪瘟病毒（ASFV)的B646L基因建立了敏感、特异、高效的ASFV实时荧光RPA快检方法，最低质粒检测限达到2 10 copies/L；刘小青等15 根据副溶血弧菌irgB建立的副溶血弧菌实时荧光RPA检测方法，菌体细胞基因组灵敏度为1.0 10 3CFU/mL;Liao等【16 建立的副溶血弧菌和霍乱弧菌双重实时荧光RPA检测方法，能检测到的最低副溶血弧菌菌体细胞浓度为99 CFU/L。为进一步提高基层和养殖现场VpAHPND的监测效率，本研究拟建立针对VpAHPND的实时荧光RPA检测方法，在引物探针设计方面，考虑pirB毒素主要决定了VpAlPND的致病力6,且pirB的侵染速度快于pirA，在对虾不同组织中pirB先于pirA检出，检出率最高5,7 ,为更有利于疾病的早期诊断和提高检测效率，本研究选择pVA1质粒中pirB基因的保守序列设计了3组引物和exo探针组合。经筛选Group2的扩增效率较高，通过反应体系和反应条件优化后，所建立的RPA检测方法在3min内就可观测到荧光信号值，约15min完成检测。该方法敏感性高，质粒检出限为1.17 10 copies/L,所能检测的最低菌体细胞浓度达到了3.8 10 CFU/mL；特异性强，仅副溶血弧菌特定毒力株（VpAHPND）核酸检测为阳性，与其他虾类主要病原WSSV、IH H NV、D IV1、EH P及霍乱弧菌、志贺氏菌、沙门菌、非毒力株的副溶血弧菌不发生交叉反应，且具有较好的重复性此外，本研究建立的VpAHPND实时荧光RPA检测方法与刘小青等15 建立的副溶血弧菌实时荧光RPA检测方法和Liao等16 建立的副溶血弧菌双重实时荧光RPA检测方法相比，灵敏度更高；与WOAH推荐的实时荧光qPCR方法8 的比对试验结果显示，二者对质粒标准品和细菌基因组DNA的检测限均在同一个数量级，灵敏度相当。Mai等17 基于pirA和pirB基因建立了一种检测VpAHND的RPA方法，该方法在39恒温条件下反应30 min，灵敏度达到了5copies/L，但该方法需通过凝胶电泳仪分析检测结果，从而使检测时间超过1h,限制了其在基层实验室和养殖场的应用。通过上述比较表明，本研究建立的VpAHPND实时荧光RPA检测方法具有较高的敏感性，所用时间短，特异性强，操作方便，且对仪器依赖性低，仅用简单、易携带的恒温荧光设备即可完成反应，非常适用于条件简陋的基层实验室和养殖场现场检测。使用该方法对50 份人工感染的南美白对虾样品进行临床检测，检测结果与WOAH推荐的实时荧光qPCR方法8 符合率为100%，表明该方法实用性强。另外，本研究在进行引物设计时对NCBI上登录的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、欧文氏弧菌和坎贝氏弧菌携带的pVA1质粒的pirB基因进行了比较分析,这些基因序列相似度高，但由于暂未获得携带pVA1质粒的哈维氏弧菌、欧文氏弧菌和坎贝氏弧菌，待后续获得后再进行本方法的测试应用。综上所述，本研究建立的VpAND实时荧光RPA检测方法操作方便、反应时间短、所用仪器简便易携带，且特异性强、灵敏度高，具有较强的应用价值，为生产中VpAHPND的现场监测提供了一种更适用的高效检测新方法。近年,Aranguren等18 研究发现副溶血弧菌分离株R14携带突变的pVA1质粒，该质粒的PirA/B基因不能完整表达PirA/B毒力蛋白，且在使用该菌株进行感染试验时不会造成感染虾的死亡。这使当前普遍基于PirA和PirB毒力基因建立的VpAHND分子生物学检测方法在疾病诊断时面临假阳性风险，在该毒素被抑制的机制尚不清楚的情况下，建议生产者或疾病防控技术人员在进行AHPND诊断时，将VpAHPND的分子生物学检测结果与疾病的临床症状、组织病理学特征等结合进行疾病诊断的综合判断。同时建议科研工作者密切关注AHPND研究进展，开展相关研究，进一步阐明VpAHPND菌株毒素被抑制的现象是否普遍存在及相关的机制参考文献(References)1李吉云,沈辉,孟庆国,等.对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)流行病学、诊断方法及防控措施的研究进展J.海洋科学,2 0 2 1,45(3)：16 3-17 2.LI Jiyun,SHEN Hui,MENG Qingguo,et al.Researchprogress on the epidemiology,diagnosis,preven-tion and control of acute hepatopancreas necrosis何知宇）69田飞焱等：急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌实时荧光RPA快速检测方法的建立第1期in shrimpJ.Marine Sciences,2021,45(3):163-172.(in Chinese).2TRAN L,NUNAN L,REDMAN R M,et al.Determination ofthe infectious nature of the agent of acute hepato-pancreatic necrosis syndrome affecting penaeidshrimpJ.Diseases of Aquatic Organisms,2013,105(1):45-55.3LEE C T,CHEN I T,YANG Y T,et al.The opportunisticmarine pathogen Vibrio parahaemolyticus becomesvirulent by acquiring a plasmid that expresses adeadly toxinJ.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,2015,112(34):10798-10803.4DONG X,CHEN J Y,SONG J P,et al.Evidence of the hori-zontal transfer of pVAl-type plasmid from AHPNDcausing V.campbellii to non-AHPND V.owensiiJ.Aquaculture,2019,503:396-402.5LAI H C,NG T H,ANDO M,et al.Pathogenesis of acutehepatopancreatic necrosis disease(AHPND)in shrimpJ.Fish&ShellfishImmunology,2015,47(2):1006-1014.6DANGTIP S,SIRIKHARIN R,SANGUANRUT P,et al.AP4 methodfor two-tube nested PCR detection of AHPND isolatesof Vibrio parahaemolyticusJ.Aquaculture Reports,2015,2:158-162.7李昊，张铭洋，于永翔，等.对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌双重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立与应用J.渔业科学进展，2 0