直立密穗基因dep2-1388的遗传分析及在杂交稻中的育种利用论文正文终稿.doc
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1、直立密穗基因DEP2-1388的遗传分析及在杂交稻中的育种利用胡运高1,2,郭连安2,杨国涛2,钦鹏1,范存留2,彭友林2,严维3,何航3,李仕贵11.四川农业大学水稻研究所,成都 611130;2.西南科技大学水稻研究所,绵阳 621010;3.北京大学生命科学院,北京 100871摘要:通过EMS诱变籼型重穗恢复系蜀恢498,获得一个直立穗突变体R1338。与野生型相比,突变体表现为植株变矮、穗直立、穗长变短、一次枝梗变短、着粒密度增加、穗部抗弯曲力极显著增强、籽粒增宽增厚、粒长变短。组织细胞学分析发现,穗颈节直径、纤维素含量和木质素含量在穗部抗弯曲上发挥了重要的作用。遗传分析表明该直立穗
2、表型受一对半显性核基因DEP2控制,通过重测序以及MutMap方法定位发现,在R1338突变体中,DEP2第7外显子有一个A到G的碱基置换,导致第928个精氨酸(AGG)被置换成甘氨酸(GGG),推测R1338直立穗性状可能由DEP2中该SNP导致。用R1338、野生型与不同穗型不育系分别配组,R1338与弯曲穗不育系所配组合穗部表现半直立,且保持较高的结实率和杂种优势,与DEP1直立穗不育系配组表现为基因累加效应的直立穗。本研究还讨论了直立穗突变体R1338在杂交水稻育种中的利用价值。关键词:水稻; 直立穗; 基因定位; 群体密度; 育种应用Genetic analysis of dense
3、 and erect panicle 2 allele DEP2-1388 and its application in hybrid rice breedingYungao Hu1,2, Lianan Guo2, Guotao Yang2, Peng Qin1, Cunliu Fan2, Youlin Peng2,Yan Wei3, Hang He 3, Shigui Li11. Rice Research Institute of Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;2. Rice Research Institut
4、e of Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China3. College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, ChinaAbstracts: Using ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenesis, we isolated an erect panicle mutant, R1338, from indica heavy-panicle restorer Shuhui498. Compare
5、d with wild type control, the mutant displayed dwarfism, erect and short panicle, short primary panicle branch, increased grain density, short grain length and increased grain thickness. In addition, the erect panicle architecture of R1388 resulted in significant decreased bending moment and increas
6、ed resistance to panicle bending. Histocytological analysis indicated that the diameter of uppermost internode, cellulose content and lignin content play important roles in resistance to panicle bending. Genetic analysis revealed that the mutant phenotype was controlled by a semi-dominant nuclear ge
7、ne. With resequencing and MutMap analysis strategy, we found that one SNP from A to G at the seventh exon of DEP2 resulted in the 928th amino acid substitution from arginine (AGG) to glycine (GGG) in R1338 mutant. Considering the phenotype of other dep2 mutants, the phenotype of R1338 was likely to
8、be caused by the SNP in DEP2. The mutant R1338 and wild type were crossed with several sterile lines which respectively had different panicle types, the combinations generated from R1338 and curve panicle sterile lines showed semi-erect panicle, higher seed setting percentage and heterosis, and the
9、combinations generated from R1388 and erect panicle sterile line with DEP1 showed erect panicle by gene additive effect. Moreover, the combinations with semi-erect panicle had superior light transmittance and stronger light intensity, which improved efficiency of light utilization to intermediate an
10、d subjacent leaves compared to the combinations with curved panicle. This study provides a good strategy to solve the problem of population density in three-line hybrid rice.Keywords: rice; erect panicle; gene mapping; population density; breeding application水稻直立穗群体通透性较好,有利于群体充分利用光能,促进CO2扩散,提高群体光合效率
11、,增加作物产量,直立穗型水稻还有利于增强品种的抗倒性1,2。因此,直立穗型被认为是继矮化育种之后,水稻株型适应超高产育种的又一重要形态学变化3,且直立粳稻品种已得到大面积推广利用。目前,已克隆的直立穗基因包括DEP14、EP2/DEP2/SRS15-7、EP38、DEP39、FUWA10和SG111, 其中直立穗基因DEP1已经在北方粳稻生产上获得大面积应用,而其他直立穗基因在生产上是否具有应用潜力,目前还不清楚。长江上游稻区属于寡日照稻区,栽培稻以籼稻为主,但对于籼稻直立穗型水稻品种的应用却鲜有报道。对籼型直立穗水稻品种的研究和育种应用,将有助于进一步解析调控水稻直立穗型的分子机制,提高寡日
12、照稻区水稻的光能利用效率。本研究通过对籼型直立穗突变体R1338的基因定位,比较野生型和突变体穗弯曲性、穗颈结构、生化成分等差异,旨在探讨直立穗突变体R1338穗部保持直立的原因,为进一步研究直立穗型水稻形成的分子机制奠定基础。通过突变体R1338与野生型分别同水稻“三系”不育系杂交配组,比较研究了后代群体的产量性状及群体生态差异,探讨了籼稻直立穗突变体在杂交育种上的应用价值。1材料和方法1.1供试材料与试验设计重穗型杂交稻骨干恢复系蜀恢498 (R498)及EMS诱变蜀恢498获得的遗传稳定的直立穗突变体R1338;生产应用的弯曲穗三系不育系川农1A(CN1A)、川农1B(CN1B)以及无花
13、粉核不育材料川农1S(H1S);以含DEP1基因的粳稻直立穗辽粳9号为供体亲本进行回交,转育至BC4代再结合系谱选择,育成的籼型直立穗不育系E69A。本研究所用材料均由四川农业大学水稻研究所提供。2013年R1338分别与R498和CN1B杂交构建遗传分析群体;同时利用R498和R1338分别与不育系CN1A、CN1S和E69A配制6个杂交组合:CN1A/R498、CN1A/R1338、H1S/R498、H1S/R1338、E69A/R498和E69A/R1338。2014年夏在西南科技大学试验基地种植R1338和R498,R1338与R498和CN1B的F1、F2群体,以及6个杂交F1群体。
14、试验材料于4月10日播种,5月12日移栽,栽插规格:33.3 cm 16.7 cm;其中6个杂交F1群体,采用随机区组设计,3次重复,小区行长10 m,5行区。试验田为沙壤土,肥力中上。1.2方法1.2.1穗颈节组织切片及木质素测定在水稻开花后20 d分别取R498和R1338主穗的穗颈节,用 10 % 氢氟酸脱硅25 d,冲洗后用 FAA 固定液固定,用番红、固绿染色,按石蜡制片法制作永久制片,切片厚度10 m。经显微观察后,取有代表性的切片用OLMPUS-2显微摄像,用图象处理软件(Axio-vision Rel. 4.6)计算穗颈横截面积、髓腔面积、茎壁面积12。同时取稻穗摘除籽粒,保持
15、枝梗完整,于105下杀青0.5 h,再于80烘箱中烘干,通过高速粉碎机粉碎,然后过80目筛,过筛后的粉末进行化学成分测定。纤维素和木质素含量的测定参照FOSS公司FibertecTMM61020/1021型纤维素测定仪的操作手册进行。1.2.2穗抗弯曲指标的测量在水稻开花后20d分别测量R498、R1338和6个杂交F1群体的5个单株主穗的穗颈弯曲度(剑叶叶枕到穗尖的连线与茎秆延长线的夹角),同时取稻穗保鲜,称量鲜重后摘除籽粒,保持枝梗完整。用HP-5型推拉力计(乐清市艾德堡仪器有限公司)推去粒稻穗的1/2处,至稻穗弯曲90时推力即为稻穗的抗弯曲力;游标卡尺测定穗颈节的直径、壁厚等性状。1.2
16、.3遗传分析与候选基因克隆1.2.3.1遗传分析直立穗突变体R1338与R498和CN1B杂交的F1和F2群体成熟时,按穗型分类统计群体中弯曲穗、半直立穗和直立穗的植株数量,进行遗传分析。穗型分类按照徐正进13粳稻穗型分类方法结合籼稻特性将F2群体及杂交F1分为直立穗型(穗弯曲度45)、半直立穗型(45穗弯曲度90)、弯曲穗型(穗弯曲度90)。1.2.3.2基因定位 利用MutMap方法 10在R1338/R498的F2群体中取25株表型明显的直立穗单株的叶片,剪取每一叶片上面等面积的部位混合在一起,用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取基因组DNA,构
17、建隐性池,与R498一并送诺禾致源生物信息科技有限公司进行重测序。以R498序列为参考序列,采用SOAPsnp软件( index0.8, read depth5)为参考,结合生物信息学手段确定突变位点。1.2.3.3候选基因验证进一步选取R1338/R498的F2群体中100株直立穗的叶片,按每10株的叶片等量混合提取DNA,共构建10个DNA池。针对突变位点,设计测序引物,正向引物AL40: 5 -ACTCGGTGTCATCAACTTCGTC-3,反向引物AL37: 5-TTGCTCCACCTCCTTACCAACT-3,扩增上述10个DNA样本,其PCR扩增产物由成都擎科梓熙生物技术有限公司
18、测序,利用DNAMAN软件进行序列比对,验证突变位点。1.2.4不同杂交组合产量及穗部性状比较在水稻开花后20 d测定6个杂交F1群体的穗抗弯曲特性。水稻成熟后,每小区收100株计产,并按照实收小区面积计算各组合亩产(kg/667m2)并按平均分蘖数取有代表性的植株进行考种,分别调查株高、分蘖数、穗长、穗着粒密度、实粒数、一二次枝梗数、一二次枝梗着粒数、籽粒长宽等性状。1.2.6数据处理采用Excel 2003进行试验数据的整理和分析,用DPS 7.05数据处理系统对数据进行方差分析。2结果与分析2.1突变体R1338的农艺性状突变体R1338与野生型R498比较,株高略低,穗长变短,穗部着粒
19、密度增大,粒宽和粒厚增加,粒长缩短,千粒重降低了2.11 g,穗型直立,分蘖数和穗平着粒数无显著差异(图1,表1)图1 野生型R498与R1338的表型。A:R498与R1338的成熟植株。标尺为10cm。B:R498与R1338的主穗。标尺为2cm。C和D:来自R498与R1388主穗上的籽粒。C中标尺为5mm,D中标尺为10mm。AD中左边为R498,右边为突变体R1338。表1野生型R498和突变体R1338的形态特征比较性状R498R1338 株高(cm)117.151.3398.901.23*分蘖数5.001.334.000.90穗长(cm)26.701.0720.551.00*每穗
20、着粒数222.1836.13221.4826.25着粒密度8.310.4210.870.23*结实率(%)0.920.030.850.02*粒长(mm)10.010.638.090.55*粒宽(mm)2.860.233.380.04*粒厚(mm)5.130.136.140.08*千粒重(g)34.671.0632.560.61*注:* P0.05, * P0.01。2.2突变体R1338穗部抗弯曲性及组织学观察、成分分析R1338与野生型R498穗部弯曲相关性状比较分析结果表明(表2),穗长和一次枝梗长度变短,一次枝梗着生密度增加,穗抗弯曲力是野生型的3倍。R1338穗主轴和枝梗的纤维素和木质
21、素含量显著高于野生型R498,其中木质素含量提高17.89%,纤维素含量提高2.76%(表3);因此R1338相对较短的穗长和枝梗长度,枝梗着生密度的增加以及纤维素和木质素含量的提高是保持穗直立的可能原因。表2 野生型R498与突变体R1338穗抗弯曲相关指标比较材料一次枝梗数一次枝梗着生密度一次枝梗长度(mm)抗弯曲力(N)弯曲力矩(cmg)R49815.730.710.550.0315.900.680.110.01353.5414.55R133816.550.48*0.770.02*11.400.61*0.340.04*271.6530.16*注:* P0.05, * P0.01。R133
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