天然产物结课论文怀山药中提取多糖的研究.doc

天然产物的分离与纯化结课论文怀山药中提取多糖的研究学 院：物理化学学院专业班级：应用化学1001学 号：311013030106_姓 名：李 晓 静_成 绩：_授课老师：斯琴格日乐摘要:对山药多糖的提取工艺进行优化, 在单因素试验基础上选取试验因素与水平利用响应面法 ,根据BoxBenhnken中心组合试验设计原理采用三因素三水平的响应面分析 法 ,依据回归分析确定各工艺条件的影响因子,以山药多糖提取率为响应值作响应面和等高线。在分析各个因素的显著性和交互作用后，得出山药多糖浸提的最佳工艺条件。关键词：怀山药 多糖 提取分离 响应面分析Abstract: The optimum conditions for the extraction of diosccorea polysaccharide were studied. On the basis of single factor experiments, the optimum conditions for extraction of Diosccorea polysaccharide were obtained through Box-benhnken center-united experiment design and Response Surface Methodology.Keywords: Polysaccharide; Diosccorea; extraction separation;Response Surface Methodology; 前 言山药是我国传统的药食同源食物之一。主产于河南，湖南、湖北、江西等省区亦产。以焦作一带出产的山药品质最好、药效最高，又称怀山药。表面黄白色或淡黄色，有纵皱纹及须根痕。去皮者称“光山药”，表面白色，光滑细腻，有微细维管束线纹。质坚实，断面白色，粉质。味微酸，带黏性。本品性平，味甘。用于治疗脾虚食少、久泻不止、慢性肠炎、肺虚喘咳、肾虚遗精、慢性肾炎、糖尿病、遗尿、白带等病症。山药主要含有蛋白质、糖类、维生素、脂肪、胆碱和淀粉酶等成分，并含有碘、钙、铁和磷等人体不可缺少的微量元素，具有很高的营养价值及药用价值。目前，多糖的提取方法主要有热水法、碱液法、酶水解法、热水法和微波法，超声波法与其它方法相比，设备小，成本低，操作简单。多糖含量的测定国内一般采用分光光度法, 显色剂多为苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法。但是蒽酮- 硫酸法易受色氨酸含量较高蛋白质的影响, 因此本试验以怀山药为原料，利用超声波强化提取水溶性怀菊花多糖，选用苯酚-硫酸法对怀山药粗多糖的提取含量测定进行正交实验设计，为怀山药产品的质量检测提供参考。目 录前 言2第一章 概论41) 怀山药主要化学成分及其药用价值42) 多糖的组成及其生理活性43) 实验仪器的使用原理54) 研究的内容与意义5第二章 多糖提取分离与纯化方法的研究51) 多糖提取分离的原理与方法52) 粗糖的纯化方法5第三章 实验设计51) 实验设计的原理52) 实验所需的仪器与药品63) 实验的具体操作步骤6第四章 实验的结论与展望71) 实验的结论与分析72) 山药的应用前景73) 天然产物的发展前景8致 谢8参考文献9一、概论1）怀山药主要化学成分及其药用价值山药中含有大量淀粉及蛋白质、B 族维生素、维生素C、维生素E、葡萄糖、粗蛋白氨基酸、胆汁碱、尿囊素等，作为中药可以健脾益胃，助消化，滋肾益精，有强健机体、益肺止咳、降低血糖、抗肝昏迷、延年益寿的作用。山药营养物质与活性成分山药块茎主要含淀粉、蛋白质、游离氨基酸等营养成分 , 以及多糖( 包括黏液质及糖蛋白) 、尿囊素、淀粉酶、胆碱、3, 4二羟基苯乙胺、胆甾醇、麦角甾醇、油菜甾醇、谷甾醇、多酚氧化酶等多种活性成分, 这些化学成分是山药营养价值和活性作用的物质基础。山药的最大特点是含有大量的黏蛋白 。黏蛋白是一种多糖蛋白质的混合物, 对人体具有特殊的保健作用, 能防止脂肪沉积在心血管上, 保持血管弹性, 阻止动脉粥样硬化过早发生, 可减少皮下脂肪堆积; 能防止结缔组织的萎缩, 预防类风湿关节炎、硬皮病等胶原病的发生。山药含有丰富的蛋白质, 谷氨酸的含量最高, 半必需氨基酸精氨酸也有较高含量, 其次为丝氨酸和天冬氨酸, 说明山药是氨基酸较丰富的食品, 有很高的营养价值。山药含有丰富的微量元素Zn、Fe、Mn、Cu、Se 和常量元素Ca 。其中微量元素Zn、Fe 对体内多种酶有活性作用, 对蛋白质和核酸的合成、免疫过程和细胞的繁殖都有直接或间接的作用, 能调节细胞免疫功能。 2）多糖的组成及其生理活性多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的单糖组成的多糖称为多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以没的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。山药多糖是山药目前公认的主要药效成分。从结构上说既有均多糖、杂多糖，也有蛋白复合多糖。有文献报道山药多糖中的糖基组成以甘露糖为主，各种多糖相对分子量分布于7103Da2106Da范围，其含量为0516。另外，炮制方法对山药黏液质多糖的含量也有影响。3）实验仪器的使用原理TU-1900双光束紫外可见分光光度计原理：分子的紫外可见吸收光谱是由于分子 中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息，可以用标准光谱图再结合其它手段进行定性分析。朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即A= kcl 式中比例常数k与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。 组成：各种型号的紫外可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。4)研究的内容和意义主要研究怀山药的主要成分和药用价值，多糖的化学组成和生理活性，在了解的基础上更好的应用在医药的研发和应用，食品保健等方面，从而使怀山药有一个更为广阔的发展前景。二、多糖的提取分离与纯化方法的研究1) 多糖提取分离的原理与方法提取原理：根据多糖水溶醇沉的理化性质，采用浸提法对怀山药中的多糖进行提取与分离多糖的提取方法：碱液法、酶水解法、热水法和微波法，超声波法等2) 多糖的纯化方法本实验采用乙醇溶液对提取的粗糖进行纯化，通过正交试验找到最适当的物料比，在此物料比下进行多糖的纯化三、实验设计1) 实验设计的原理采用热水浸提法提取怀山药多糖，对影响提取多糖工艺参数如浸提温度、浸提时间、料水比等进行单因素实验，并在此基础上设计正交试验，提出提取怀山药多糖最佳工艺条件2）实验所需的仪器与药品仪器：TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器)；HH4智能数显恒温水浴锅(郑州长盛实验仪器有限公司)；KQ300VDB型三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BS224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器厂）；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱（上海恒科仪器有限公司；SH B-111循环水泵(郑州长盛实验仪器有限公司)；微型砂芯漏斗（安徽千玻仪器厂）。药品：1mgml-1葡萄糖对照品：苯酚、浓硫酸、葡萄糖、乙醇试剂；实验用水为去离子水，实验材料为河南焦作市售新鲜怀山药。3） 实验的具体操作步骤3.1怀山药的预处理将新鲜怀山药少量置于干燥箱中55烘干24h。将干燥的怀山药粉碎，备用。3.2 怀山药多糖的提取将制备好的怀山药干粉取0.1g怀山药干粉置于具塞三角瓶中，加入2 ml蒸馏水75热水中提取1小时。减压抽滤。,浸提完毕后取出冷却, 4000r/ min, 离心10min, 分离上清液与沉淀物。上清液浓缩冷却, 加入4倍体积无水乙醇, 静置12h，收集沉淀后干燥得淡黄色固体，用蒸馏水溶解，加入0.05 molL的MgC12溶液和无水乙醇沉淀。离心取上清液，减压浓缩至少许，干燥得怀山药粗多糖，粗多糖提取率为0.624%。 3.3 多糖含量的测定331 最大吸收波长的确定取葡萄糖标准溶液和粗多糖溶液各2.5ml，加入5%的苯酚1mL和浓硫酸6mL, 混合均匀后,显色30min, 空白对照以去离子水代替, 在400- 600nm 波长范围扫描，选取最大吸收波长488nm为测定波长。332 标准曲线的制作将配置好的葡萄糖标准溶液, 精密吸取葡萄糖对照品溶液0.3 ml，0.4ml,0.6 ml，0.9 ml，1.2 ml，1.5 ml置于15mL具塞刻度试管中, 分别加入蒸馏水至体积为2mL, 加入1mL苯酚和6mL硫酸,混合均匀后,显色30min, 在最大吸收波长处测定吸光度, 空白对照以重蒸水代替糖溶液。以糖浓度( C)为横坐标, 吸光度( A)为纵坐标,制作标准曲线。结果：回归方程为Y0.01398X0.00669，R0.9998(n=6)，线性范围0-78.8g/ml。334 测定方法的优化 (1) 单因素实验实验选择热水温度、浸提时间、料液比、乙醇用量进行单因素实验。(2) 正交实验设计根据单因素实验结果, 选取热水温度、浸提时间、料液比、乙醇用量为考察因素, 采用正交设计实验, 分别测定吸光度, 优化分析测定条件。因素水平见表表：正交试验（四因素三水平） Table1 Factors and levels水平Levels温度(A)时间min(B)料液比g/mL(C)乙醇用量mL(D)140301：20304050250601：25360901：30四、实验的结论与展望1） 实验的结论与分析4.11 乙醇浓度对怀山药多糖提取率的影响随着乙醇浓度的升高，吸光度也随着升高当乙醇浓度达到60mL，吸光度达到最大值，再增加乙醇的浓度，吸光度下降，因此最适宜的乙醇浓度为60mL。4.1.2料液比用量对怀山药多糖提取率的影响随着料液比的升高，吸光度也随着升高，当料液比为1:30g/mL时，吸光度达到最大值，再增加料液比，吸光度下降，因此最适宜的料液比为1:30g/mL。4.1.3热水温度对怀山药多糖提取率的影响随着温度的升高，吸光度也随着升高，超声温度达到100时，吸光度达到最大值，再升高温度，吸光度下降，因此最适宜温度为100。4.1.4时间对怀山药多糖提取率的影响 随着时间的增加，吸光度也随着升高，当超声时间120min时，吸光度达到最大值，再增加时间，吸光度下降，因此最适宜的四为120min。结果表明：通过正交试验得出最佳浸提工艺为：浸提温度100，料液比l：30，浸提时间2 h，浸提2次，再向浓缩液中加入6倍体积的无水乙醇溶液分离怀山药多糖。2）山药的应用前景近年来, 我国医药工作者进行了不懈努力, 在中草药包括山药的研究方面取得了许多成果, 但仍有不少问题, 诸如质量标准的深入研究、规范化种植的研究、生药炮制新方法的研究以及相关保健食品及药物的深度开发研究等, 尚有待于继续深入。由于山药在人们日常保健和抗衰老方面的作用, 使山药更受到重视。如从墨西哥野山药中提炼并经过深加工而成的保健食品青春源片(DHEA) , 即脱氢表雄酮就是人体生命活动中非常重要的一种活性物质。我国大面积种植的山药也有墨西哥野山药类似的作用。因此, 山药的开发利用前景会越来越广阔。3）天然产物的发展前景随着社会的不断发展，科技的不断进步，人们的各种观念也在随之改变。特别是对身心的健康越来越重视，对环境、食物、医药、日常用品等要求也是越来越高。所以没有危害成份的纯天然产物就越来越受广大人群的喜爱，于是关于天然产物的研究也随之兴起。天然产物是指动物、植物、昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许许多多内源性的化学成分统称作天然产物。近年来，对天然生物产物的研究逐渐扩展和深入，尤其是海洋生物活性物质的开发利用。概括的讲，天然产物是指通过精细化工、生物化学技术，从天然原料中提取分离出的具有独特功能和生物活性的化合物。致谢时间如梭，转眼这一年就结束了。回想这一年，心中充满无限感激。首先，感谢学校为我们提供了良好的学习环境和实验操作设备，使我们能够在此专心学习，陶冶情操。同时谨向我的授课老师斯琴格日乐致以最诚挚的谢意！在这一年里，斯琴老师为我们讲授了生物化学、天然产物的分析与纯化两门专业课，使我们对于生命科学有了进一步的了解，她不仅在学业上言传身教，而且以其高尚的品格给我以情操上的熏陶。本文的写作更是直接得益于她的悉心指点，从论文的选题到体系的安排，从观点推敲到字句斟酌，无不凝聚着她的心血。滴水之恩，当以涌泉相报，师恩重于山，师恩难报。我只有在今后的学习、工作中，以锲而不舍的精神，努力做出点成绩，以博恩师一笑。另外，我必须感谢我的父母。焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报。作为他们的孩子，我秉承了他们朴实、坚韧的性格，也因此我有足够的信心和能力战胜前进路上的艰难险阻；也因为他们的日夜辛劳，我才有机会在这里学习，进而取得进一步发展的机会。参考文献【1】徐琴;徐增莱;沈振国淮山药多糖提取工艺的研究期刊论文-食品工业科技 2006(12)【2】姜芳婷，李明静，史会齐，等山药的研究【J】河南人学学报(医学版)，2004，23(2)：4-6【3】乔善义，王立岩，赵毅明等山药多糖的提取分离和结构测定【J】中国天然药物，2003，1(3)：155-157【4】李锋涛，陈毓山药的研究进展【J】海峡药学，2008，20(10)：9093【5】廖朝晖，朱必风，刘安玲，等山药主要生化成分含量的测定【J】韶关学院学报：自然科学，2003， （6）：6769【6】舒媛;刘安军;王丽霞山药多糖结合蛋白质对抗氧化作用的影响期刊论文-食品研究与开发 2006(11)【7】苗明三怀山药多糖抗氧化作用研究【J】 1997(02)【8】孔晓朵, 白新鹏山.药的活性成分及生理功能研究进展【J】安徽农业科学2009, 37(13) : 5979- 5981【9】王震宙，黄绍华.山药中的功能保健成分及其在食品加工中的应【J】保健食品【10】邵文斌，山药生物学特性及高产高效栽培技术现代农业科技【J】.2011 年第3 期【11】 郭本功.山药的药用【J】.食物养生,2003（4）：45【12】 孔晓朵，白新鹏.山药的活性成分及生理功能研究进展【J】.安徽农业科学，2009,37（13)：59795981,5984 【13】 宋永刚,胡晓波,王震宙.山药的活性成分研究概况【J】 .江西食品工业, 2007,4：45-48【14】王涛.我国山药的药用食用开发利用研究【J】.农村经济与科技,2002,13（6）：40-41 【15】李锋涛，陈毓.山药的研究进展【J】.海峡药学,2008,20(10):91-92课 程 设 计 说 明 书课程名称： 新编生物工艺学设计题目：怀山药多糖成分提取院 系：生物与食品工程学院学生姓名： 学 号：200706030016专业班级：07生物工程指导教师： 关 现 军 年 月 日课 程 设 计 任 务 书设计题目怀山药多糖成分提取学生姓名易萌所在院系生物院专业、年级、班07生物工程一班设计要求：学生应完成的工作：研究水浸提法提取怀山药多糖、用三氯乙酸法除蛋白及乙醇分离多糖的纯化条件。通过四次试验、获得如下最佳工艺条件：温度100、加水量1:30、加入10%的3%三氯乙酸溶液除蛋白效果最好、加入浓缩5倍体积的无水乙醇是较好的纯化工艺。参考文献阅读：【1】范俊安，周斌山药水溶性多糖提取工艺的初步研究J重庆中草药研究，1999，39：20222】毛丽珍，撩世芳，等天赐胶囊中多糖的含量测定J】中草药，200l，32(3)：2152163 苗明三怀山药多糖对小鼠免疫功能的增强作用J】中药药理与临床，1997，13(3)：25264】苗明三怀山药多糖抗氧化作用研究【J】中国医药学报，1997，12(2)：22235】陈金秀，高松颖，等怀庆山药对小鼠脑内单胺递质水平的影响【J】.中国中药杂志，1998,23（11）：693694.工作计划：用开始两周的时间进行课程设计的实验，包括实验设计、实验准备、实验实施、实验结果的记录、实验的后续补充。实验全部完成后，进行课程设计的撰写，讨论实验结果，提出问题、解决问题、得出结论与探索的新方向，完成本次课程设计。任务下达日期： 年 月 日 任务完成日期： 年 月 日指导教师（签名）： 学生（签名）： 怀山药多糖成分提取摘 要：研究了水浸提法提取怀山药多糖、三氯乙酸法除蛋白及乙醇分离多糖的纯化条件。水浸提正交实验结果表明，温度100、加水量1：30、时间2h和浸提次数2次为最佳工艺条件；真空浓缩提取液至三分之一，加入10的3三氯乙酸溶液除蛋白效果最好；再加入浓缩液5倍体积的无水乙醇是较好的纯化工艺。最后讨论杂蛋白去除各种方法的比较。关键词：怀山药，多糖，水浸提法，三氯乙酸目 录1.设计背景11.1怀山药简介21.2怀山药多糖成分提取的意义32.设计方案页码2.1原材料制备 页码2.2多糖成分的粗提取 页码2.3获得最佳温度最佳加水比 页码2.4三氯乙酸法除蛋白.页码2.5多糖分离无水乙醇 页码2.6总工艺流程列叙 页码3.方案实施页码3.1原材料制备具体实施 页码3.2多糖成分的粗提取具体实施 页码3.3获得最佳温度最佳加水比具体实施 页码3.4三氯乙酸法除蛋白具体实施页码3.5多糖分离无水乙醇具体实施 页码4.结果与结论页码4.1水浸提实验最佳工艺条件页码4.2多糖纯化后的含量页码5.收获与致谢页码6.参考文献页码7.附件页码.1. 设计背景1.1怀山药简介山药又名薯蓣，原名薯豫。属薯蓣科，为多年生植物。山药形似萝卜，用筷去皮后，肉呈白色，煮熟后糯软味美。它的块根除去外皮后，可入药。山药加工后呈园柱形，表面黄白色，光滑，质坚硬，断面白色、粉质，气微甘味酸，嚼之发粘。山药原产中国，南北各省均有栽培，尤以怀庆府所产山药名贵。怀山药又称白山药、怀参，为全国之冠。神农本草云：山药各地均产，以河南怀庆各地产者良。 山药中含有皂碱、粘液质、尿囊素、胆硷、精氨酸、淀粉酶、蛋白质、维生素C、B、4一二羟基苯乙胺等，粘液中含甘露聚糖与植酸。其性味甘、平、入肺、脾、肾经，具有健脾止泄、补肺益肾之功用。主治脾虚、久泻、慢性肠炎、肺虚咳喘、慢性肾炎、糖尿病、遗精带下、小便频数等症。怀山药为滋补佳品，素有怀参之称。据本草纲目记载山药补虚羸，除寒热邪气，补中，益气力，长肌肉，强阴，久服耳目聪明，轻身延年。怀山药中含有大量的蛋白质、各种维生素和有益的微量元素、粘质多糖等, 还含有尿囊素、山药素、皂苷、胆碱、盐酸多巴胺等药用成分, 是营养价值很高的药食同源食品, 有健脾、补肺、固肾、益精等功效, 具有强身健体及医疗保健作用。怀山药是我国传统的地道药材之一，历史悠久，其质量为各名医家所称道。怀山药为滋补佳品，素有“怀参”之称。据本草纲目记载“山药”补虚羸，除寒热邪气，补中，益气力，长肌肉，强阴，久服耳目聪明，轻身延年。近年来, 外贸上对山药的需求也日益增大。1.2怀山药多糖成分提取的意义现代医学确认怀山药含有丰富的蛋白质(包括十八种氨基酸)、淀粉酶、糖（甘露糖、半乳糖、葡萄糖）、粘液质、维生素（维生素B2、维生素C）、无机元素及其他微量元素如钙、锰、铜、铬、钼、铁、锶、钒、钡，此外还有胆碱和糖蛋白。粘液质是山药中最重要的药理作用成分，有多糖和蛋白质复合体组成。近期研究表明，怀山药多糖具有重要的生理活性。 怀山药全身都是宝，加工过程中产生的下脚料可制作山药粉、山药饮料、山药酱、怀山药保健果冻、山药软糖等保健食品。然而，目前山药相关饮食品开发还处于起步阶段，相关成分及其含量还未充分阐明，有效成分的提取工艺还很不完善，使山药的价值得不到充分利用。因此，研究怀山药中粘质多糖等药用成分的高效提取工艺，追求其最优提取工艺可以使怀山药得到充分利用，对生产和工艺化研究具有重大意义。2.设计方案 采用热水浸提法提取怀山药多糖，对影响提取多糖工艺参数如浸提温度、浸提时间、料水比等进行单因素实验，并在此基础上设计正交试验，提出提取怀山药多糖最佳工艺条件：温度100、加水量1：30、时间2h和浸提次数2次。2.1原材料制备将山药洗净，之后去皮，切碎，再进行组织搅碎匀浆，加水在水浴锅里加热，之后冷却，将冷却液固液分离，收集上清液，再次浸提沉淀，收集所有上清液。获得怀山药多糖成分提取的原材料溶液。2.2多糖总量的提取取10g怀山药匀浆，按1:30加水，在不同温度(80,90,100)下浸提2小时，除去沉淀，收集上清液，用苯酚硫酸法测定总糖含量。2.3获得最佳温度最佳加水比采用水浸提取法、一浸提可溶性总糖含量作为指标2.4三氯乙酸法除蛋白对3%三氯乙酸溶液的加入量做单因素试验，以蛋白质沉淀和多糖的率为目标2.5多糖分离无水乙醇对无水乙醇加入量做单因素试验，均已多糖沉淀率为指标2.6总工艺流程列叙工艺流程：山药洗净去皮切碎组织搅碎匀浆加水加热冷却固液分离收集上清液再次浸提沉淀收集所有上清液上清液低温浓缩至1/3加入3%三氯乙酸溶液摇匀静置固液分离得蛋白质多糖溶液多糖溶液加入无水乙醇摇匀静置固液分离得多糖沉淀烘干 3. 方案实施3.1原材料制备将山药洗净，之后去皮，切碎，再进行组织搅碎匀浆，加水在水浴锅里加热，之后冷却，将冷却液固液分离，收集上清液，再次浸提沉淀，收集所有上清液。获得怀山药多糖成分提取的原材料溶液。3.2多糖总量的提取取10g怀山药匀浆，按1:30加水，在不同温度(80,90,100)下浸提2小时，除去沉淀，收集上清液，用苯酚硫酸法测定总糖含量。苯酚硫酸法测多糖含量简介：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 原理;多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 试剂;1 浓硫酸：分析纯，95.5% 2 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 4 标准葡聚糖或分析纯葡萄糖。 5 3%三氯乙酸（3%TCA）：3克TCA加97克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 6 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 7 6mol/L 盐酸 操作：1制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。2样品含量测定： 取样品1克（湿样）加1ml 3%TCA溶液，倒上清液于10毫升离心管中。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 离心，转速3000转/分钟15分钟，取上清液。最后滤液保持18毫升左右。 定容取样。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 注意：（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 （2）制作标准线宜用相应的标准多糖，入用葡萄糖，应以校正系数0.9校正g数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.10.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。3.3获得最佳温度最佳加水比采用水浸提取法、一浸提可溶性总糖含量作为指标。具体采用热水浸提法，在恒温水浴中加热 2 小时，初步获得多糖。具体步骤：4） 取10g怀山药匀浆，按1:30加水，在不同温度(80,90,100)下浸提2小时，除去沉淀，收集上清液，用苯酚硫酸法测定总糖含量。5） 取10g怀山药匀浆，按不同比例加入蒸馏水(1:20,1:30,1:40)，在100下浸提2小时，除去沉淀，用苯酚硫酸法测总糖含量，6） 取10g怀山药匀浆，按1:30加水，采用不同时间(1h,2h,3h)在100下浸提，出去沉淀，用苯酚硫酸法测得总糖含量。7） 绘制图像得到单因素最佳实验条件。5. 做三因素三水平正交分析，试验次数为9次。如下表：3) 测得个次总糖含量，进行正交分析，得到最优搭配。3.4三氯乙酸法除蛋白对3%三氯乙酸溶液的加入量做单因素试验，以蛋白质沉淀和多糖得率为目标。具体步骤：a、将最优条件所得的上清液、分成三份、然后浓缩成三分之一、b、用ph试纸或者ph计测所、 用HCL或NaOH（或氨水）直接调ph到7c、加入的3%三氯乙酸量依次为浓缩体积的5%、10%加入后摇匀、离心、得到蛋白沉淀、d、用烘干机30度烘干 、测得蛋白质的量3.5多糖分离无水乙醇对无水乙醇加入量做单因素试验，均已多糖沉淀率为指标a、这个我们额外做、100度、1:30、浸提两小时、7.5%浓缩体积的3%三氯乙酸、我们做两个、100g*2山药、分成两份 b、两个分别加5倍、3倍体积的乙醇。4. 结果与结论4.1水浸提实验最佳工艺条件综合单个影响怀山药水浸提工艺的因素，从实验的可行性来考虑，最终得到提取怀山药多糖最佳工艺条件：温度100、加水量1：30、时间2h和浸提次数2次。图1.最佳温度最佳加水比下的总糖含量比较图2.最佳浸提次数图3.浸提温度的影响图4.浸提时间的影响4.2怀山药多糖纯化后多糖含量三氯乙酸无水乙醇多糖量5%1：4 100:0.97.5%1：3100：1.051: 4100：1.171: 5100：1.31图一.怀山药多糖纯化后多糖含量比较图二.无水乙醇加入量的影响注：随着无水乙醇量的增多，多糖得率提高，但增加到1:5（V/V）之后，多糖得率的增加幅度不大，故无水乙醇加入量确定为多糖溶液：无水乙醇为1:5（V/V）。4.3杂蛋白去除方法的比较将蛋白酶解法、三氯乙酸沉淀法、NaoH法和Sevag法分别做验证实验。脱蛋白过程中使蛋白质沉淀的机理可能是造成多糖损失的主要原因, 三氯乙酸沉淀法脱蛋白效果最好且多糖得率最高。三氯乙酸沉淀法：多糖溶液中逐渐加入3%TCA并不断搅拌，同时观察溶液中是否有沉淀生成；若有，则过滤沉淀。实际过程：采用了40ml 3%的鞣酸（浅黄色），样品由原来的深褐色变成较深的棕红色，容器底部有沉淀生成。Sevage法：将等体积的多糖溶液加入分液漏斗，加入Sevage试剂（Sevage/样品约大于1/2）,摇均后静置分层，除去白色泡沫层和下层有机相，重复35次，保留上层液体，有机相从下方倒出，回收。NaoH法：向样品中滴加1mol/L的NaoH溶液，使溶液的PH在碱性范围内，去除沉淀后，调整PH至中性（1mol/L盐酸），记录处理后的体积。酶法：原料酶解液离心后所得上清液中加入氯仿正丁醇混合溶液进行充分振荡，将游离蛋白变性成为不容物质，经离心分离去除，测定水相中蛋白残余量。5. 收获与致谢经过两周的实验和之前的选题与最后的课程设计撰写，本课题最终形成了定稿。在这样的过程中，我得到了很多人的帮助，特在此感谢。在选题及进行过程中得到关现军老师的悉心指导。论文行文过程中，关老师又多次帮助我分析思路，开拓视角，在我遇到困难的时候给予我最大的支持和鼓励。关老师严谨求实的治学态度，踏实坚韧的工作精神，使我终生受益。在此，谨向老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。 感谢我院实验室所有老师对我进行实验时的帮助和关怀，正是您们的辛勤工作，认真指导才使我得以顺利地完成实验，完成对本课题的探索。在此期间，我不仅学到了许多新的知识，而且也开阔了视野，提高了自己的设计能力。其次，我要感谢我们组的全体成员，没有大家的相互配合、相互帮助，也就没有我们最后的成功。我们共同思考解决了不少难题，为我以后在求学生活的道路上打好了坚实的基础。最后再一次诚挚的感谢所有在设计中帮助过我的良师益友和亲爱的同学们。6参考文献1苗明三.怀山药多糖对小鼠免疫功能的增强作用J.中药药理与临床，1997,13（3）：25262苗明三.怀山药多糖抗氧化作用研究J. 中国医学报，1997,12（2）：22233陈金秀，高松颖，等.怀庆山药对小鼠脑内单胺递质水平的影响J. 中国中药杂志，1998,23（11）：6936944范俊安，周斌.山药水溶性多糖提取工艺的初步研究J.重庆中草药研究，1999,39:2022.5毛丽珍，撩世芳，等.天赐胶囊众多糖的含量测定J.中草药，2001,32(3):2152166梁兰兰、阮征、陈欣荣，米糠多糖提取工艺研究J粮食与油脂，2003，047孟庆华、胡永涛、罗军等，怀山药多糖的提取J食品工业科技，2005,02,0378李宏霞，许 闵，孟 江怀地黄多糖的含量测定J.河南科学，2002，20(2)：144.9 卢晓林怀药多糖提取及其降血糖作用研究D.天津科技大学研究生学位论文，2007：17. 附件图一. 怀山药多糖纯化后多糖含量图二. 水浸提实验最佳工艺条件指导教师评语：课程设计报告成绩： ，占总成绩比例： 课程设计其它环节成绩：环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 总 成 绩： 指导教师签字：年 月 日本次课程设计负责人意见：负责人签字：年 月 日30