枯草芽孢杆菌母药统一标准.doc
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1、G25 Q 江苏苏滨生物农化有限公司公司原则 Q/320922 BN 032-1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药-0818发布 -0830实行江苏苏滨生物农化有限公司 发布前 言本原则按照 GB/T1.1原则化工作导则 第1某些:原则构造和编写和GH/T2467.8农药母药产品原则编写规范进行编制而成。本原则附录A为规范性附录。本原则附录B为资料性附录。本原则由江苏苏滨生物农化有限公司提出并起草。本原则重要起草人:赵福兵、许军、沈文权。 引 言1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药是我公司自行研制开发微生物发酵产品。1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药通过加工可以重要用于防治水稻纹枯病、稻曲病
2、。经测定1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药对大白鼠经口毒性LD50雌、雄性均4640mg/kg,经皮毒性为LD50雌、雄性均2150mg/kg。 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药本品有效成分其她名称、构造式和基本物化参数如下:a)枯草芽孢杆菌 中文通用名称:枯草芽孢杆菌+菌株编号。 拉丁学名:Bacillus subtilis。分类地位:细菌(Bacteria);厚壁菌门(Firmicutes);芽孢杆菌纲(Bacilli);芽孢杆菌目(Bacillales);芽孢杆菌科(Bacillaceae);牙孢杆菌属(Bacillus)。 形态学特性:菌体呈杆状,单个、成对或短链排列,大小为0.
3、7m0.8m2.0m3.0m,无荚膜,周生鞭毛,能运动;芽孢0.6m0.9m1.0m1.5m,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大;革兰氏染色阳性;菌落圆或不规则形,表面粗糙不透明,可以起皱,呈奶油色或污白色。有效成分重要存在形式:芽孢。重要生物活性:抑菌(防病)。 培养保存条件:最适生长温度为3037;适合培养基为营养琼脂(NA)或营养肉汤(NB)培养基;适当贮存温度为04。1 范畴本某些规定了细菌微生物农药枯草芽孢杆菌母药规定、实验办法、检查与验收以及标志、标签、包装、贮运。本某些合用于以芽孢为重要活性成分粉状枯草芽孢杆菌母药。2 规范性引用文献下列文献中对于本文献应用是必
4、不可少。凡是注日期引用文献,仅注日期版本合用于本文献。凡是不注日期引用文献,其最新版本(涉及所有修改单)合用于本文献。GB/T 1601-1993农药pH值测定办法GB/T 1604-1995商品农药验收规则GB/T 1605-商品农药采样办法GB 3796-农药包装通则GB/T 8170- 数值修约规则与极限数值表达和鉴定GB/T16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定办法3 术语和定义 下列术语和定义合用于本文献。3.1 枯草芽孢杆菌母药Bacillus subtilis technical concentrates(TK)由枯草芽杆菌纯菌种经发酵而获得高含量芽孢菌粉,普通状况下
5、还会包括随着发酵过程少量生物组分和化学杂质。3.2 菌落形成单位 colony forming units(cfu) 是将枯草芽孢杆菌母药用水稀释后得到菌泫通过涂布办法,让其单个芽孢分散在琼脂平板上,待培养后每活芽孢形成一种菌落,即一种菌落形成单位(cfu),通过肉眼观测菌落数量来推算单位微生物农药样品中活芽孢含量。3.3 杂菌数 number of microbial contaminants枯草芽孢杆菌母药样品中,除枯草芽孢杆菌菌落以外其她微生物菌落数之和。3.4 杂菌率 rate of microbial contaminants枯草芽孢杆菌母药样品中除枯草芽孢杆菌外,其她菌(真菌和细菌
6、等)量占总菌量百分率。3.5 贮存稳定性 storage stability枯草芽孢杆菌母药在室温和(或)低于室温下贮存一定期间后,产品活菌数占其标明值相对百分率。4 规定4.1 外观:普通为灰白色或棕褐色粉状物,由于发酵基质不同颜色偶有差别,但应为均匀疏松粉末,不可有团块。4. 2 枯草芽孢杆菌母药质量控制项目指标应符合表1规定。表1 枯草芽孢杆菌母药质量控制项目指标项 目指 标含孢量,亿cfu/g 100050杂菌率,% 2.5pH值范畴5.08.0 干燥减量,% 50细度(通过45m实验筛),% 90贮存稳定性a,% 80a为定期检查项目3个月检测一次。5 实验办法 除另有阐明,本办法所
7、用试剂均为化学纯及以上,所用溶液均为水溶液。5.1 抽样按照GB/T 1605规定进行样品采集,用随机数表法拟定抽样包装件,最后抽样量不少于100g。采样时必要特别注意样品代表性和避免污染,采样容器和采样工具应通过消毒灭菌,样品采集后应及时进行检查,若不能及时检查,需贮存在4冰箱中。5.2 菌种鉴别依照代表菌株形态学和生理生化特性进行菌种鉴别,并可辅助脂肪酸分析、Biolog、16SrRNA序列分析等手段。当对鉴别成果有争议或需要进行法律仲裁检查时,应到具备菌种鉴定资质单位,将待检菌种与模式菌种进行比对,出具菌种鉴定报告,作为仲裁根据。鉴别办法见附录A。5.3 含孢量测定5.3.1 办法提示采
8、用平板菌落计数法。将母药润湿、稀释后,均匀涂布在培养基平板上,待各芽孢菌体形成菌落后,记录菌落总数,以单位样品(g)中菌落形成单位数(cfu)表达活芽孢含量(cfu/g)。5.3.2 试剂和溶液试剂:Tween-20或Triton X-100;溶液:0.05%Tween-20或0.05%Triton X-100。5.3.3 重要仪器、设备天平:精度为0.01g移液器:20L200L,200L1000L;高压蒸汽灭菌器;超净工作台;恒温振荡器;恒温培养箱。5.3.4 实验环节5.3.4.1 样品准备在无菌操作条件下,将样品搅拌均匀,精确称取3.0g样品,溶入27.0mL含0.05% Tween-
9、20或0.05%Triton X-100无菌水中浸泡30minb后,振荡30min,得到稀释10倍样品溶液,标记为0号。然后参照表2(以稀释7次为例)进行梯度稀释。表2 梯度稀释示例编号01234567灭菌水体积,mL27.09.09.09.09.09.09.09.0加入上一稀释浓度溶液体积,mL-1.01.01.01.01.01.01.0合计稀释倍数10-110-210-310-410-510-610-710-85.3.4.2 涂板计数将上述各梯度稀释液分别吸取100L于NA平板上,并用L形玻棒均匀涂布在整个平板表面,每1稀释度做3次重复,然后置于37培养24-48h后,选取适当稀释度,取菌
10、落数在30300个之间平板进行计数。5.3.5 菌落总数计算办法5.3.5.1 若只有一种稀释度平板上菌落数在适当计数范畴内,则计算该稀释度3个重复平板菌落数平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g实验中菌落数。如第7号稀释度3个平板菌落数分别为98、100、102,则该试样菌落数:N= (98+100+102)310810=1.01011cfu/g5.3.5.2 如有两个持续稀释度平板菌落数均在适当计数范畴之类,则按式(1)计算: N=C / (1n1+0.1n2) 0.1d (1)式中:N单位样品(g) 中菌落数(cfu/g)C平板(含适当范畴菌落数平板)菌落数之和n1第1个适当稀释度
11、调查平板数n2第2个适当稀释度调查平板数d第1稀释度稀释因子 示例:如果第1稀释度(10-7)菌落数(cfu)为110、105、100,第2稀释度(10-8)菌落数(cfu)为15、16、17,则依照式(1)计算。N=(110+105+100+15+16+17)/(13+0.13)0.110-8=1.11011cfu/g5.4 杂菌率测定按5.3办法进行测定,NA培养基检测样品中细菌杂菌;选取PDA培养基检测样品中真菌杂菌。然后记录总可见杂菌菌落数量,杂菌率按式(2)计算。X=N1+N2100(2)N1+N2+N3式中:X杂菌率,单位为百分率(%);N1细菌杂菌菌落数总和,单位为cfu;N2真
12、菌杂菌菌落数总和,单位为cfu;N3有效成分枯草芽孢杆菌菌落数总和,单位为cfu。5.5 pH值测定 按GB/T 1601-1993规定进行。5.6 细度测定 按GB/T 16150-1995中2.2规定进行。5.7 干燥减量测定5.7.1仪器、设备扁形称量瓶:直径40mm;电热干燥箱:控温范畴(50200),误差2;干燥器。5.7.2 实验环节 称取试样10g(精准至1mg),置于预先恒重称量瓶中,将此瓶放入1052电热恒温干燥箱内干燥,1h后取出,在干燥器中冷却至室温,称重。5.7.3 测定成果干燥减量按式(3)计算。W =m-m1100(3)m式中:W干燥减量,单位为百分率(%);m试样
13、质量,单位为克(g);m1干燥后试样质量,单位为克(g)。5.8 贮存稳定性5.8.1 办法提纲将试样密闭放置于 5贮存24个月或2025贮存12个月后,对含孢量进行测定,计算其占标明值百分率,规定不低于80%。5.8.2 仪器、设备冰箱;恒温箱:控温范畴(050),控温误差2;玻璃瓶:带有密封盖或瓶塞,能充分保证其密封性。5.8.3 实验环节将20g试样放入玻璃瓶中,使其铺成平滑均匀层,密封后置于5冰箱中放置24个月或2025恒温箱中放置12个月后按5.3办法测定样品中含孢量,并计算其占标明值百分率。6 产品检查与验收应符合GB/T 1604-1995规定。极限值解决应按GB/T8170-中
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