烟酰胺高产菌种筛选及烟酰胺检测生产工艺优化正稿模板.doc
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1、高酶活烟酰胺生产菌株筛选及腈水合酶催化反应条件优化摘要烟酰胺作为B族维生素关键组员,参与了机体内两种关键辅酶形成。烟酰胺作为关键营养性添加剂被广泛应用于应用于饲料生产行业,其在医药、食品、化妆品行业应用前景也很宽广。在工业生产方面,大家关键利用化学法和微生物法进行烟酰胺生产。烟酰胺微生物生产法有着化学法无法比拟优越性,此方法对环境几乎不造成污染,且生产成本低,工艺简便。在本试验中,关键以下四个方面进行了试验研究并取得了一定结果:(1) 以试验室现有菌种HD1220为出发菌株,分别使用ARTP诱变、微波诱变、EMS诱变三种单因子诱变和在各因子最好诱变条件下复合诱变,确定了复合诱变最好条件为:AR
2、TP诱变时间240 s;微波诱变强度60 %,微波照射时间90 s,;EMS浓度0.8 %。诱变完成后,筛选出一株能够稳定遗传且酶活高达1764U高腈水合酶活性菌株,和出发菌株相比,诱变后菌株酶活提升了33.13 %,并将该菌株临时命名为NHD-1。 (2)利用HPLC对烟酰胺进行检测,经过对HPLC检测紫外检测波长、流动相流量、流动相百分比三个条件进行单原因优化试验,最终确定HPLC检测烟酰胺各个最优条件为:紫外检测波长为220 nm,流动相流量为0.4 mL/min,流动相中甲醇:水=1:3。在以上条件下,烟酰胺出峰时间为5.306 min,和条件优化前相比,烟酰胺出峰时间显著缩短。(3)
3、 对腈水合酶参与烟酰胺生产过程中酶催化反应条件进行单原因优化试验,我们得出各原因最好条件为:菌体浓度1.8 %,菌龄48 h,底物浓度100 g/L,温度29.5 ,PH 7.4,反应时间30 min,在实际发酵后期应该对产物烟酰胺进行立即分离。经过Plackett-Burman试验设计我们分析出底物浓度、温度和PH这三个原因对腈水合酶酶活有及其显著影响;经过对这三个原因进行响应面优化设计,我们得出了这三个原因最好条件组合为底物浓度98.88 g/L,反应温度29.59 ,PH值7.46。在此条件下酶活响应值为1784 U。对SAS软件统计分析结果进行三次验证试验,得到腈水合酶实际酶活为177
4、5 U,和多元回归分析所得理论值吻合,说明利用响应面法能够很好优化酶催化反应条件。ABSTRACTNicotinamide is a kind of Vitamin B and its very important. In the body, Its one part of the formation of two kinds of coenzyme. Nicotinamide is mainly used in feed industry as nutrition additives, it also has a very broad application prospect in medi
5、cal industry, food industry and cosmetics industry. In the industrial production of nicotinamide ,we mainly use chemical method and biological method. The biological method has a big superiority that chemical method hasnt it does little harm to the environment and has a lower production cost, and it
6、s very simple in process.Under the conditions of laboratory, we mainly carried out our research in several aspects and achieved some results as follows:(1) Started from the strain Norcardia sp.HD9611 we had in the laboratory, we used the method of ARTP mutagenesis, microwave mutagenesis and EMS muta
7、genesis to make mutagenesis of the strain. The three methods were all used alone. Then we made the composite mutagenesis under best conditions of the three method of mutagenesis. The best conditions of composite mutagenesis were: the time of ARTP mutagenesis was 240 s; the time and intensity of micr
8、owave were 90 s and 60 %; the concentration of EMS mutagenesis was 0.8 %. By the mutagenesis we screened one stain whose nitrile hydratase had a very high enzyme activity of 1764 U and the stain had stable heredity. Compared to the stain Norcardia sp.HD9611, the enzyme activity increased by 33.13 %,
9、 and we named the stain as NHD-1.(2)In the detection of Nicotinamide, we used the HPLC method. By optimizing the wavelength of UV detection, the flow rate of mobile phase and the proportion of mobile phase in the HPLC assay, we got the best conditions of HPLC method : the wavelength of UV detection
10、was 220 nm; the flow rate of mobile phase was methanol: water=1:3; the proportion of mobile phase was 0.4 mL/min. under these conditions, the peak time of niacinamide was 5.306 min. Compared to the method before optimization we used, the peak time significantly shortened. (3) By optimizing the condi
11、tions of catalytic reaction of the nitrile hydratase, we got the best conditions: the concentration of bacteria producing niacinamide was 1.8 %; the fungus age was 48 h; the concentration of substrate was 100 g/L; the temperature was 29.5 ; the PH was 7.4; the reaction time is 30 min, and we should
12、separate nicotinamide late in the actual fermentation. By Plackett-Burman experiment we confirmed that conditions of concentration of substrate, temperature, PH had significant influences on the enzyme activity of nitrile hydratase. By response surface test we optimized these three factors: the conc
13、entration of substrate was 98.88 g/L; the temperature was 29.59 ; the PH was 7.46. Under these conditions, we analyzed the enzyme activity is 1784 U. Through verification test, we confirmed the enzyme activity of nitrile hydratase was 1775 U. It was very close to the theoretical value. It showed tha
14、t the response surface test was a very effective method in optimization of enzyme catalysis.Key word: mutagenes nitrile hydratase enzyme activity HPLC optimization 1序言1.1烟酰胺概述 1.1.1烟酰胺介绍烟酰胺(Nicotinamide)化学名称为3吡啶甲酰胺,又维生素B3英文简称VB3、NSA1。烟酰胺最早从动物肝脏中提取,市场上销售产品多为化学合成品2。烟酰胺分子式图1-1:图1-1 NSA分子式 Fig.1-1 The s
15、tructure of NSA1.1.2烟酰胺化学性质 烟酰胺为白色针状结晶或结晶性粉末。熔点为128 131 ,沸点为150 160 。烟酰胺极易溶于水,在通常极性有机溶剂溶解,在苯和乙醚中无溶解性3。烟酰胺在空气中对光、热等条件稳定,干燥状态50 以下极其稳定。1.1.3烟酸介绍烟酸又称尼克酸,分子式为C6H5NO2,其整体性质和烟酰胺极其相同,但因为羧基存在造成在一些方面不用和含有酰胺基烟酰胺。二者通称维生素PP(二者混合物),在实际应用中,二者可相互等量替换4。在加热条件下有没有机酸和碱存在条件下,烟酰胺发生水解反应转化为烟酸。烟酸分子式图2图1-2 烟酸分子式Fig.1-1 The
16、structure of niacin1.1.4烟酰胺用途烟酰胺参与生物体内糖原分解、脂类代谢及多种物质氧化作用5。烟酰胺有促进细胞新陈代谢等等作用6。当烟酰胺缺乏时会出现细胞正常代谢不能正常进行,糖原分解受阻等情况而引发糙皮病。在市场上烟酰胺共分为三种:医药级、食品级和饲料。烟酰胺最关键作为营养添加剂在饲料广泛应用,在食品和医药行业关键以维生素形式为大家所使用,烟酰胺在电镀及生化方面也有一定应用7。医学上常见来诊疗糙皮病、口炎、舌炎、肝脏疾病及日光性皮炎药品中均含有烟酰胺,其也被用来降低人体胆固醇和甘油三酯含量8。烟酰胺应用最广泛应用是在饲料工业,其作为关键饲料添加剂而被大量应用9。1.1.
17、5国外和中国烟酰胺生产及消费情况 在20世纪50年代,国外烟酰胺生产已经实现工业大批量生产。现在全世界烟酰胺总产能约为30 kt/a,总产量也突破了20 kt/a10。世界上瑞士、美国、比利时、印度、西班牙等国家为烟酰胺关键产出国等,瑞士龙沙企业(LONZA)、美国Nepera企业、比利时Reilly Tor AG企业等是烟酰胺生产方面巨头,这些企业年产能均在千吨以上,瑞士Lonza企业以35 %生产能力在烟酰胺生产行业首位。烟酰胺消费有40 %50 %作为饲料添加剂应用在饲料生产方面;25 %30 %应用于食品生产加工;20 %25 %应用于医药生产方面。美国年均消费烟酰胺量在约10000
18、t以上,占世界消费总量二分之一,消费中80 %作为饲料添加剂使用。西欧烟酰胺消费量也很大。烟酰胺关键出口于日本。伴随第三世界国家饲料等工业高速发展,烟酰胺消费量正以每十二个月超出5 %速度快速增加12。中国在20世纪50年代初开始进行烟酰胺生产,首家进行烟酰胺生产企业在上海。中国在70年代烟酰胺年产量仅在100左右,因为此时中国烟酰胺生产还处于刚起步阶段,在设备、规模等方面还存在着很大不足。90年代初,伴随国外优异生产技术引进,中国出现了多家从事大规模生产烟酰胺企业,比较著名有南通醋酸化工股份、广州龙沙精细化工、浙江富阳胜大生化科技、山东潍坊一邦化工科技等13。其中广州龙沙是最早引进国外优异生
19、产技术进行烟酰胺大规模生产企业,它是由中国广药和瑞士龙沙双方合资建设而成,年产烟酰胺达3400 t。到20世纪早期,中国烟酰胺年生产能力超出8000 t企业已经有6家,而且实现了对东南亚地域规模性输出 14。和国外烟酰胺应用一样,中国所消费烟酰胺关键用于饲料工业,比重占到总消费量约80 %。1.2烟酰胺生产工艺1.2.1烟酰胺化学合成法 利用化学合成法进行烟酰胺生产依旧是现在工业上主流工艺。化学合成工艺原材料关键是吡啶类物质,关键利用多种化学物质和吡啶类物质氧化反应来生产烟酰胺。应用氧化方法首先得到烟腈,以后将烟腈在适宜条件下进行碱水解得到烟酰胺1517。在氧化生产过程中,吡啶类物质和烟酰胺原
20、料产出比约为0.95:1,所以工业上烟酰胺产量决定性原因依旧是原材料物质产量。1.2.2烟酰胺微生物发酵法 和化学工艺相比,烟酰胺微生物生产法有着独特优势:(1)反应条件温和,通常在常温常压下既能完成,没有爆炸、污染严重等问题。(2)原材料物质易得且廉价。微生物发酵所用原料通常为淀粉、糖蜜或其它农业副产品,不需要精制处理即可直接用于发酵生产。(3)微生物自主调控。微生物参与反应通常全部有本身酶系或代谢机制调解完成,无需过多认为参与。(4)高度专一性和选择性。因为微生物体内酶含有专一性,所以微生物本身能够专一性对一些复杂化合物进行特定部位等氧化、还原、官能团导入等等反应从而实现生产。(5)环境污
21、染小。微生物发酵工业“三废”对环境污染小,对生物体也基础无害。这是微生物发酵相比于通常发酵最为显著地优越性。(6)此方法投资较小,见效较快,而且在效益方面潜力巨大。所以,针对烟酰胺生产来说,实现微生物发酵生产烟酰胺含有很重大意义,这也将改变烟酰胺生产工业长久以来部分难以改变不利原因18。法国研究员Galzy及其研究组最早提出了烟酰胺微生物发酵方法19,而且在试验过程中确定了烟酰胺发酵菌株。以后经过对微生物转化腈类物质必需腈水合酶进行深入研究,经过研究得出腈水合酶参与反应所需最好条件,该企业实现了腈水合酶活力不停提升,并让丙烯酰胺产量实现三次大幅度提升,到二十一世纪早期,丙烯酰胺产量已经提升到0
22、 t/a。中国利用腈类物质进行工业生产起始于90年代中期,利用微生物转化腈类物质进行丙烯酰胺生产著名企业有江苏如皋化肥厂,江西南昌农科化工 20。1.3腈水合酶介绍1.3.1腈水合酶在微生物界分布腈类化合物通常是由和工业生产中一些物质间反应所产生副产物,这些物质通常含有很高毒性,存在于工业废水,腈类物质极难被分解掉,而微生物体内腈水合酶是腈类物质最好催化剂。腈类物质对人体来说毒性较强,不过这种物质却能够作为碳源或氮源为微生物所利用。自然界中存在能够利用腈类物质微生物种类很多,但通常利用率很低,以后科学家们将这些微生物进行人工驯化培养,经过改变微生物生长条件及代谢机制,实现了微生物腈水合酶活性提
23、升。腈水合酶关键存在于短杆菌属、小球菌属及诺卡氏菌属等等。这些菌属中常见微生物菌株有:Nocardia sp.9611,Brevibacterium imperialis CBS489-74,Rhodocaccus rhodochrous JI, Corynebacterium pseudodiphterium ZBB-41,Breviterium R312,Rhodocaccus sp.N-774,Rhodocaccus sp. YH3-3,Alcaligenes faecalis ARCC8750,Alcaligenes faecalis JM,Pseudonocarda thermoph
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