激光衍射法测定西格列他钠粒径分布.pdf

中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2147DOI:10.19803/j.1672-8629.20230434 中图分类号：R927.1文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2024）02-0147-05基金项目：国家重点研发计划（2023YFC2410202）。作者简介：郭宁子，女，助理研究员，化学药品质量控制。*通信作者：魏宁漪，女，研究员，化学药品质量控制。E-mail：#为共同通信作者。新型降糖药物西格列他钠是我国自主研发的新药，用于 2 型糖尿病的治疗。将西格列他钠原料药直接压片制成制剂，其原料药粒径分布会影响药物的溶出，进而对其口服生物利用度产生影响。因此粒径分布是其制剂生产过程中的一项重要指标，建立准确、快速的粒度测定方法对于本品的生产工艺和质量控制具有重要意义。激光衍射（散射）法是目前原料药粒度测定的主流方法，分为干法和湿法1。湿法测定的前提是供试品能完全分散在溶剂中2。西格列他钠易溶于水，在正己烷中聚集成团，漂浮在水面上，不能有效分散，添加表面活性剂（司盘 80）后，会明显提高西格激光衍射法测定西格列他钠粒径分布郭宁子1，刘丽1，岳瑞齐2，冯慧庆3，杨化新1，魏宁漪1*，陈华1#（1中国食品药品检定研究院，北京 102629；2国家药典委员会，北京 100061；3马尔文帕纳科有限公司，北京 100040）摘要：目的建立西格列他钠的粒径分布测定方法，为药物粒径测定的方法开发和质量控制提供参考。方法采用MALVERN Mastersizer 3000 激光衍射粒度仪和AEROS 干法进样器建立西格列他钠的粒径分布方法。背景测量持续时间 7 s；样品测量持续时间7 s；遮光度0.5%5%；样品分散气压 0.4 MPa；进样速度 60%；文丘里管类型为高能文丘里管；料斗间隙 2.5 mm。结果3 批样品粒径分布特征值 d(0.1)在1.021.17 m，d(0.5)在 5.946.69 m，d(0.9)在 20.7022.40 m，平均标准偏差（RSD）均小于1%。结论建立了西格列他钠的粒度测定方法，可为其他易引湿药物的干法粒径测定方法开发提供参考。关键词：激光衍射法；西格列他钠；粒径分布；易引湿药物；干法测定Determination of particle size distribution of chiglitazar sodium by laser diffraction methodGUO Ningzi1,LIU Li1,YUE Ruiqi2,FENG Huiqing3,YANG Huaxin1,WEI Ningyi1*,CHEN Hua1#(1National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 102629,China;2Chinese Pharmacopoeia Commission,Beijing 100061,China;3Malvernpanalytical Co.,Ltd.,Beijing 100040,China)Abstract:Objective To establish a laser diffraction method for determination of the particle size distribution of chiglitazar sodium so as to provide reference for the development and quality control of methods for determination of drug particle size.Methods The Malvern Mastersizer 3000 laser particle size analyzer with an AEROS dry sampler was used to establish a laser diffraction method for determination of the particle size distribution of chiglitazar sodium.As for the AEROS injector,the conditions of determination were as follows:the duration of background measurement was 7 s,the duration of sample measurement was 7 s,obscuration ranged from 0.5%to 5%,the sample dispersion pressure was 0.4 MPa,the injection speed was 60%,high energy venturis were used,and the hopper gap was 2.5 mm.Results The particle size distribution value of the three batches of samples ranged from 1.02 to 1.17 m in d(0.1),5.94 to 6.69 m in d(0.5),and 20.70 to 22.40 m in d(0.9).The RSD of the above values was below 1%.Conclusion A particle size determination method has been established for chiglitazar sodium,which can provide reference for the development of dry particle size determination methods for other hygroscopic drugs.Keywords:laser diffraction method;chiglitazar sodium;particle size distribution;hygroscopic drugs;dry measurement列他钠的溶解度，因此西格列他钠不适合湿法分析，故选择干法作为西格列他钠的测定方法。此外，西格列他钠具有引湿性，粉末易黏连、聚集，流动性差，给干法分析增加了难度。已有文献报道的仪器参数设置（压力、样品量、进样速度）会对干法粒径测定产生较大影响3-6，但尚未有报道考察仪器型号和干燥处理对干法粒径测定的影响。在日常检验或是方法开发阶段，经常会面临以下问题：对于同一品牌的激光粒度仪，能否将一种型号的仪器参数直接转移到另一种仪器上；不同型号仪器的测定结果是否一致。Mastersizer 3000 和 Mastersizer 2000 是市面上常见的 2 种型号激光粒度仪。本研究将以西格列他钠为模型药物，建立其粒径的干法测定方法。对比 2 种型号仪器参数和测定结果，用显微镜法加以验证，为激光衍射法方法开发、转移提供借鉴，为药物粒径测定的方法开发和质量控制提供参考。中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.21481 仪器与试药1.1 仪器激光粒度分析仪（Malvern 公司，型号：Mastersizer 3000、Mastersizer 2000）；恒温干燥箱（Memmert公司）；ECLIPSE 光学显微镜（Nikon）；恒温恒湿培养箱（Memmert 公司）。1.2 试药西格列他钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101548-202101-1、101548-202101-2 和 101548-202101-3）；甘油（国药集团化学试剂有限公司，批号：20191122，分析纯）。2 方法与结果2.1 Mastersizer 3000 型激光粒度仪测定方法影响因素考察2.1.1 干燥对样品粒径测定的影响 本品有引湿性，于25、相对湿度（RH）80%恒温恒湿箱中放置 24 h，样品增重 10.3%。在环境湿度下亦发现样品容易粘连在样品盘上，在 1001 000 m 会出现尾巴峰（图1A），提示样品没有分散完全。故将样品于105干燥 2 h 后进样分析，尾巴峰消失（图1 B）。因此确定样品的前处理方式：105干燥 2 h 后进样。图1 样品干燥前（A）和干燥后（B）粒度分布Figure 1 The particle size distribution curve of samples before(A)and after drying(B)图 2 粒径测定影响因素分散压力（A）、进样速度(B)、料斗间隙(C)和遮光度(D）（n=3）Figure 2 Determinants of air pressure(A),feed rate(B),hopper gap(C),obscuration(D)of particle size determination(n=3)察了进样速度为 50%、60%、70%下样品粒度的测定结果。结果表明，当振动进样速度为 60%时，结果可达到稳定（图 2B）。故选择进样速度为 60%。2.1.4 料斗间隙对粒径测定的影响 料斗间隙也是干法测定的关键参数，进样口宽度过小，易造成样品的静电聚集；而进样口宽度过大，样品进样量过大，易导致遮光度增大，造成多重散射5-6。本次实验考察了3、2.5、2.0 mm 不同料斗间隙对样品粒度测定结果的影响（图 2C）。在保证结果精密度和节省进样量的条件下，设定料斗间隙为 2.5 mm。2.1.5 遮光度对粒径测定的影响 遮光度与样品取样量呈正相关，对于马尔文激光粒度仪而言，干法测量遮光度通常在0.5%5%，遮光度过高会造成多重散射5-6。本次实验考察了在不同遮光度（1%、2%、4%）下样品的粒度测定结果，当遮光度为1%和 2%时，测定结果无明显差异；当遮光度为 4%时，d(0.9)的误差值增大（图 2D），可能由于浓度过高出现多重散射，故设定遮光度值为 2%。2.1.6 文丘里管对粒径测定的影响 Mastersizer 2000 型仪器只有 1 种文丘里管配置，且固定在仪器中，不可拆卸。新一代的 Mastersizer 3000 型仪器有 2 种文丘里管配置：标准文丘里管和高能文丘里管，可根据需要进行拆装。标准文丘里管采用直通设计，粒子和管壁间无直接碰撞，适合大部分类型的样品和易碎颗粒。高能文丘里管采用肘型设计，粒子和管壁间存在直接碰撞，适合极易黏结和团聚的样品4。本次实验分别取样，用标准文丘里管和高能文丘里管测定粒径。无论是干燥前还是干燥后的样品，标准文丘2.1.2 分散压力对粒径测定的影响 空气分散压力是干法测量的重要参数。在压力较低的情况下，样品易发生团聚而导致测定结果偏大；当分散压力过大时，会造成样品粉碎而导致测定结果偏小5。考察了压力0.3、0.35、0.4 MPa 对样品粒度测定结果的影响。结果表明，随着压力增大，粒径分布特征值 d（0.9）和 d（0.5）逐渐减小（图 2A）。考虑供试品易黏连、不易分散的特性，选择 0.4 MPa（可设置的最大压力）为分散压力。2.1.3 进样速度对粒径测定的影响 进样速度的选择取决于样品自身的流动性，只有当振动进样速度足够使样品分散时，才能避免样品的静电吸附现象；但较大的振动进样速度则需要增加样品用量。本次实验考中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2149里管测定的粒径特征值 d(0.1)、d(0.5)和 d(0.9)均大于高能文丘里管测定结果（表 12），且标准文丘里管测定过程中会经常出现尾巴峰（图 3），说明对于本样品而言，使用标准文丘里管无法使颗粒完全分散，因此选择高能文丘里管。2.2 激光衍射法粒径测定方法的确定和方法精密度验证2.2.1 方法的确定 取样品，置干法进样器中。设置仪器参数。颗粒类型：非球形；折射率：1.731；吸收率：0.1；背景测量持续时间：7 s；样品测量持续时间：7 s；测量次数：1 次；遮光度：0.5%5%；分析模型：通用模型；样品分散气压：0.4 MPa（Mastersizer 3000），0.25 MPa（Mastersizer 2000）；进样速度：60%（Mastersizer 3000），50%（Mastersizer 2000）；文 丘里管类型：高能文丘里管（Mastersizer 3000）；通用样品盘（带漏斗）；料斗间隙：2.5 mm。2.2.2 方法精密度验证 按 2.1.1设定参数（Mastersizer 3000），按 2.1.2 处理样品，连续测定 6 次，残差均小于 0.5%（表 3）。根据 美国药典（USP）2021版7对于平行测定的要求：d(0.5)的变异系数应小于10%；d(0.1)和 d(0.9)的变异系数不得超过 15%，数值小于10 m 时，则变异系数的最大允许值可放宽 1 倍。结合表 2 分析，同一批次样品 d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)的变异系数均符合 USP 2021 版的规定7。2.3 激光衍射法测定样品粒径本次分别采用 Mastersizer 3000 和 Mastersizer 2000 高能文丘里管测定 3 批样品的粒径（表 2）。虽然 Mastersizer 3000 和 Mastersizer 2000 测量结果一致，但仪器参数设置上存在差异。对于本品而言，Mastersizer 2000 本身分散力较强，在较低的分散压力下（0.25 MPa）和较小的进样速度下（50%），无需借助干燥的方式就可以使样品分散完全。对于Mastersizer 3000 而言，标准文丘里管无法使该样品分散完全，需要使用高能文丘里管，选择最大的分散压力（0.4 MPa），较大的进样速度（60%），并且将供试品干燥处理，才能使供试品分散完全。而就仪器精密度而言，无论是干燥前还是干燥后，Mastersizer 3000测定粒径特征值的 RSD 均小于 Mastersizer 2000，提示 Mastersizer 3000 精密度更高。2.4 显微镜法测定样品粒径USP 2021 版建议将激光衍射法结果与显微镜法进行对比，从而验证激光衍射法的准确度7。用显微镜法和激光衍射法对 3 批样品进行结果对比。显微镜法测定方法：将样品粉末少量置于载玻片上，加入甘油稀释，使粉末分散。放大倍数 1 000。测定视野为1 mm2，每批样品取 3 个视野统计个数3050 个，2 种方法测得样品粒度结果基本一致（表4），表明激光衍射法可准确表征西格列他钠的粒径。3 讨论3.1 粒径测定方法的选择常用的粒度测定方法有显微镜法、筛分法、Zeta电位法、电阻法和激光衍射法。显微镜法直观、可靠，但是主观性强，只能通过粒子的长度和宽度估测粒径，且需测定 300500 个粒子以获得较为准确的粒径分布，耗时长8；筛分法虽然简单、直观，但是样品用量大，测量误差大；Zeta 电位法适用于纳米级制剂药物的测定；电阻法通过测量电流变化测定电解质中粒子的大小和个数，可用于注射溶液的不溶表 2 Mastersizer 2000 和 Mastersizer 3000（高能文丘里管）测定对比（n=3）Table 2 Comparison between Mastersizer 2000 and Mastersizer 3000(n=3)样品批号仪器型号干燥前干燥后干燥前干燥后干燥前干燥后d(0.1)/mRSD/%d(0.1)/mRSD/%d(0.5)/mRSD/%d(0.5)/mRSD/%d(0.9)/mRSD/%d(0.9)/mRSD/%101548-202101-1 Mastersizer 30001.140.711.02 0.66 6.860.585.94 0.80 26.14 1.3320.70 0.53 Mastersizer 20001.381.041.26 0.41 6.440.855.67 0.98 22.11 1.9421.98 3.07 101548-202101-2 Mastersizer 30001.290.851.17 0.99 7.641.726.69 0.91 28.19 3.00 22.40 0.97 Mastersizer 20001.552.11.34 1.18 7.230.986.09 1.54 27.75 4.6222.20 2.89 101548-202101-3 Mastersizer 30001.191.91.14 0.66 6.911.716.37 0.72 25.48 2.1621.80 0.43 Mastersizer 20001.320.091.36 1.04 5.840.295.90 1.23 21.26 5.5121.34 6.31 表1 Mastersizer 3000 标准文丘里管测定（n=3）Table 1 Test of Mastersizer 3000 standard venturis(n=3)样品批号d(0.1)/mRSD/%d(0.5)/mRSD/%d(0.9)/mRSD/%加权残差/%干燥前 干燥后 干燥前 干燥后 干燥前 干燥后 干燥前 干燥后 干燥前 干燥后 干燥前 干燥后 干燥前 干燥后101548-202101-11.321.161.292.598.067.062.213.0936.70 34.202.210.330.150.21101548-202101-21.551.296.761.629.538.101.992.3842.53 39.773.570.740.470.10101548-202101-31.551.310.880.669.457.951.561.8143.60 41.362.494.910.420.13中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2150性微粒以及脂肪乳的乳粒检测。电阻法测量时，颗粒浓度不能太大，否则会导致测量值偏大9；激光衍射法通过测量衍射光强的空间分布得到粒径的大小和分布，具有使用范围广、粒径测量范围宽、测量精准度高、重复性好和速度快等优势10，被广泛应用于化学原料药4-6,10-11、滴眼剂12、乳膏剂13、吸入制剂2,14、微球制剂15等多种药物剂型粒径的测定，故选择激光衍射法测定本品粒径。3.2 干燥处理对粒径测定的影响样品的吸湿性是影响干法粒径测定结果的重要因素。进行干法分析的前提是样品处于干燥状态，并且流动性良好。如果样品易黏连和团聚，会影响干法测量结果的准确性。对于有引湿性的样品，在测量前将其密封保存，并且开封后尽快测量，减少其对环境中水分的吸附。若环境湿度较大，且样品在测量中仍然有团聚现象，可以用加热干燥的方式除去样品中的水分，减少颗粒的黏连和团聚，从而改善样品的分散性和流动性。对于西格列他钠而言，干燥后样品的粒径特征值均小于干燥前的样品（表 2）。干燥后样品中尾巴峰消失，也证明干燥的方式可以有效减少颗粒团聚。对于 Mastersizer 2000 仪器而言，干燥前后粒径结果差异较小，说明仪器本身就可以使样品分散完全。对于 Mastersizer 3000 仪器而言，粒径结果受干燥方式影响较大，提示对于某些易引湿的样品，高能文丘里管也不能完全使样品分散，还需要借助干燥处理。3.3 建立激光衍射法干法测定方法应考虑因素本实验研究表明，除了文献已报道的仪器参数设置（压力、样品量、进样速度）外，仪器型号和供试品的处理方式也会对实验结果产生较大影响。因此在进行方法建立时，应注明仪器的品牌、型号。建立的方法应与激光衍射湿法或者显微镜法进行比对，验证方法的准确性。若由于实验条件的限制，不同实验室仪器型号无法统一，则应考虑方法转移带来的结果偏差，必要时在另一型号仪器上应重新设置仪器参数，并进行方法验证。以本研究为例，西格列他钠标准规定的限度d(0.1)应为 0.31.5 m，d(0.5)应为 210 m，d(0.9)应为1030 m。若采用 Mastersizer 2000 进行实验，结果均符合标准规定。若采用 Mastersizer 3000 开展试验，则需要进行方法的转移，仪器参数都需要重新考察和设置。本实验建立了降糖药物西格列他钠的Mastersizer 3000 粒度测定检测方法，与 Mastersizer 2000 和显微镜法进行比对，结果准确，可为其他易引湿药物的干法粒径测定方法开发提供参考。参考文献1 LIU DX,WU XF,WANG HL,et al.Some considerations on the application of laser diffraction or scattering method in the measurment of the particle size and distribution of APIJ.Chin J New Drug(中国新药杂志),2022,31(17):1689-1692.2 SHEN DD,ZENG LG,XU J,et al.Application of the laser particle analyzer to determine the laser particle size of ciclesonideJ.Chin J Antibiot(中国抗生素杂志),2019,44(8):946-952.3 HAO F,HU XQ,BA XY,et al.Advances of application of laser diffraction technique of particle size analysis in pharmaceutical quality analysisJ.Anal Testing Technol Instrum(分析测试技术与仪器),2017,23(2):72-80.4 ZHANG YL,FENG Y,LI QX,et al.Establishment and verification of particle size test method of palbociclib by laser light scatteringJ.Chin J Pharm Anal(药物分析杂志),2019,39(3):436-440.5 WANG Y,WU S,XUE D,et al.Methodological study of particle size distribution of bromhexine hydrochloride by laser diffraction methodJ.Chin J Pharm Anal(药物分析杂志),2021，41(8):1448-1453.6 WU Y,LIU J,AN Y,et al.Methodological study on particle size distribution of methylcellulose by laser particle analyzerJ.Chin J 表 4 显微镜法和激光衍射法测定样品粒径对比（m，x-s，n=3）Table 4 Comparison of the sample size determination between microscope method and laser diffraction method（m，x-s，n=3）样品批号激光衍射法显微镜法平均粒径Mastersizer 3000 d(0.5)Mastersizer 2000 d(0.5)101548-202101-15.940.055.670.065.591.10101548-202101-26.690.066.090.095.651.23101548-202101-36.370.055.900.075.451.32表 3 Mastersizer 3000 激光衍射法粒径测定方法精密度验证Table 3 Precision of Mastersizer 3000 laser diffraction method for particle size determination测量次数d(0.1)/md(0.5)/md(0.9)/m残差/%11.307.2523.890.2321.297.1723.370.1931.277.1323.680.1941.247.0023.300.2551.287.1823.690.2161.287.1723.580.20平均值1.287.1523.590.21RSD/%1.621.160.9311.35图 3 标准文丘里管（A）和高能文丘里管（B）测定粒度分布Figure 3 The particle size distribution curve of samples using standard venturis(A)and high energy venturis(B)中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2151Pharm Anal(药物分析杂志),2019,39(4):755-7627 The United States Pharmacopeial Convention.U.S.Pharmacopeia 43S.The United States Pharmacopeial Convention,2021.8 GUO B,HAO G,QIAN X,et al.Establishment and validation of particle size distribution determination method of Rivaroxaban by laser light scatteringJ.Chin J Pharm Anal(药物分析杂志),2021,41(9):1649-1654.9 GENG ZW,HE L,ZHANG MQ,et al.Determination of droplet size of propofol fat emulsion injectionJ.Chin Pharm J(中国药学杂志),2014,49(4):338-343.10 GU GZ,WANG YM,LIU W,et al.Determination of efavirenz particle size by laser light scattering methodJ.Chin J Pharm(中国医药工业杂志),2016,7(1):67-70.11 GENG ZP,JIANG YY,LI YD,et al.Determination of valsartan particle size by laser light scattering methodJ.Chin J Pharm(中国医药工业杂志),2017,48(5):716-719.12 GAO X,CHEN XP,FAN LL,et al.Determination of particle size distribution of fluorometholone eye drops by laser light scattering methodJ.Chin J Pharm Anal(药物分析杂志),2022,42(10):1815-1821.13 DI TY,GAO YY,ZHU J,et al.Methodological study of particle size of fluocinonide cream by laser particle analyzerJ.Chin J Pharm Anal(药物分析杂志),2016,36(1):181-184.14 ZHANG HF,YU SS,CAO J,et al.Features and requirements of non-clinical toxic evaluation of inhalable drugsJ.Chinese Journal of Pharmacovigilance(中国药物警戒),2021,18(6):570-578.15 GUO NZ,XIN ZS,SUN Y,et al.Determination of size and size distribution of leuprorelin acetate microspheres for injection using laser diffraction methodJ.Chin J New Drugs(中国新药杂志),2017,26(8):886-892.（收稿日期：2023-07-21 编辑：朱蓓）参考文献1 SOPHIE GR,ANN A.Immune responses to IAV infection and the roles of l-selectin and ADAM17 in lymphocyte HomingJ.Pathogens,2022,11(2):150.2 RAVENDRA PC,MICHELLE LG.An overview of influenza A virus genes,protein functions,and replication cycle highlighting important updatesJ.Virus Genes,2022,58(4):255-269.3 CIMINSKI K,CHASE GP.Influenza a viruses:understanding human host determinantsJ.Trends Mol Med,2021,27(2):104-112.4 MARIA T,REETA SM.Proinflammatory chemokines are major mediators of exuberant immune response associated with influenza A(H1N1)pdm09 virus infectionJ.J Med Virol,2017,89(8):1373-1381.5 PAULA LM,RAQUEL MM.Differential modulation of innate immune responses in human primary cells by influenza A viruses carrying human or avian nonstructural proteinJ.J Virol,2019,94(1):1-22.6 ERIC S,WILLIAM EL.Western Cold and Flu(WeCoF)aerosol study-preliminary resultsJ.BMC Res Notes,2014,23(7):563.7 MOU X.A brief discussion on the value of the academic thought of“Plague Theory”to the treatment of epidemic diseasesJ.ZJITCWM,2021,31(6):581-582.8 SURESH R,DASHRATH M.Treatment and prevention of pandemic H1N1 influenzaJ.Ann Glob Health,2015,81(5):645-653.9 ZEINAB A,MENGYUAN L.Comparative review of SARS-CoV-2,SARS-CoV,MERS-CoV,and influenza A respiratory virusesJ.Front Immunol,2020,11(11):552909.10 ROBERT EB,VIOLETA C.Morphoproteomic features of pulmonary influenza a(H1N1)with therapeutic implications:A case studyJ.Ann Clin Lab Sci,2022,52(6):991-995.11 ERIK DV,WENJD.Influenza A virus hemagglutinin-neuraminidase-receptor balance:preserving virus motilityJ.Trends Microbiol,2020,28(1):57-67.12 TAVIS KA,JENNIFER C.Swine influenza A viruses and the tangled relationship with humansJ.Cold Spring Harb Perspect Med,2021,11(3):a038737.13 KA HW,SUNIL KL.Alternative antiviral approaches to combat influenza A virusJ.Virus Genes,2023,59(1):25-35.14 WAN Y,SUBBIAH E.Relationship between humidity and influenza A viability in droplets and implications for influenza s seasonalityJ.PLoS One,2012,7(10):e46789.15 GENG ZH,BAO YY,BAO L.Therapeutic effect of ge gen tang granules on mouse model with hCoV-229E pneumonia and Hanshi Yidu Xifei syndromeJ.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(19):34-4116 ZHAO RH,SUN J,BAO L.Protective effects of ge gen tang granules on viral pneumonia and death caused by upper respiratory tract infection in miceJ.World Chinese Medicine,2023,18(10):1385-1390.17 MARCEL GER,LISA W.Influenza A virus infection instructs hematopoiesis to megakaryocyte-lineage outputJ.Cell Rep,2022,41(1):111447.18 GUI R,CHEN Q.Molecular events involved in influenza a virus-induced cell deathJ.Front Microbiol,2022,12:797789.19 TARA MS,KARL KM.Direct IL-6 signals maximize protective secondary CD4 T cell responses against influenzaJ.J Immunol,2016,197(8):3260-3270.20 LEE H,SHIN J,LEE W,et al.Chikusetsusaponin IVa methyl ester isolated from the roots of achyranthes japonica suppress