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蛋白质翻译后修饰在细菌致病中的作用.pdf
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1、139Chinese Journal of Nature 2024 Vol.46 No.2 REVIEW ARTICLE2024 年 46 卷 2 期 专题综述 细菌感染是目前威胁人类健康的重要因素之一,如在2019年有约1 370万人患感染性疾病1。预防和控制细菌感染是人类亟待解决的重要问题之一。细菌的毒力在细菌感染的发生、发展过程中起着关键的作用,因此研究细菌毒力因子的表达调控,既可以帮助我们更好地理解细菌致病力的形成机制,又可以发现潜在的抗菌药物靶点2。蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)可调节蛋白质生物活性,在细菌感染过程中常常发挥
2、重要作用3。PTM曾被认为仅存在于复杂的真核生物中,至今已有数万个蛋白质被鉴定出存在PTM4。相比真核生物,人们对原核生物的PTM知之甚少。随着研究的进展,人们发现许多病原菌的毒力因子存在PTM,而且对细菌蛋白质合成5、代谢6、休眠7和毒力8等方面均有重要影响。本文将对近年来PTM在病原菌致病中的作用机制的研究进展进行综合评述。1 细菌中主要的PTM细菌中的PTM包括磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化、类泛素化和乳酸化修饰等。PTM可通过影响修饰残基和/或邻近区域的化学性质,显著改变蛋白质的理化性质、结构、稳定性、定位以及与其他生物分子的相互作用,从而调控细胞的代谢与生理功能3。PTM对于细菌蛋白
3、质功能的多样性至关重要,在同一个蛋白质上,可以存在不同类型的修饰和不同位点的修饰,从而指数级别扩增该蛋白质的功能,以极低的进化成本提升蛋白质组的复杂性9。大多数PTM过程是动态可逆的,除了可以通过特异性的修饰酶书写子(writer)和去修饰酶擦除子(eraser)在特定的氨基酸残基上添加或去除特定的修饰基团外,细菌中也存在着许多非酶促翻译后修饰10。*国家自然科学基金青年项目(31900111)通信作者,研究方向:病原菌致病机制及宿主天然免疫反应。E-mail:DOI:10.3969/j.issn.0253-9608.2023.03.009蛋白质翻译后修饰在细菌致病中的作用*周涛,姚玉峰,王丹
4、霓上海交通大学医学院 上海市免疫学研究所病原细菌学实验室,上海 200025;上海交通大学医学院 免疫学与微生物学系病原细菌学实验室,上海 200025;上海交通大学医学院 附属瑞金医院感染科,上海 200025;上海交通大学 生命科学技术学院/微生物代谢国家重点实验室,上海 200240;上海市呼吸传染病应急防控与诊治重点实验室,上海 200025摘要 蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)可以改变蛋白质稳定性与活性,是调控蛋白质生物学功能的重要环节之一,在真核生物与原核生物中广泛存在。PTM在细菌的许多生命活动中发挥着重要调控作用,如物质
5、代谢、信号转导和细菌致病过程等。文章综述了细菌中主要的PTM种类及功能、细菌毒力和适应力的PTM调控机制、细菌效应蛋白如何通过PTM调控宿主蛋白,以及PTM检测技术的新进展。PTM的研究对了解细菌的致病机制及其与宿主的相互作用、致病机制有重要意义,也可以开发特异性治疗药物的新靶点。关键词 蛋白质翻译后修饰;细菌;毒力;效应蛋白140Chinese Journal of Nature 2024 Vol.46 No.2 REVIEW ARTICLE1.1 磷酸化细菌中的磷酸化修饰主要发生在组氨酸(His,H)、天冬氨酸(Asp,D)、丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、酪氨酸(Tyr,Y)
6、和精氨酸(Arg,R)的氨基酸侧链上。Ser、Thr和Tyr在磷酸化时形成简单的酯键,His和Arg形成亚磷酸酰胺PN键,Asp则形成混合酸酐或酰基磷酸酯,不同的磷酸化侧链具有不同的化学稳定性和功能9。磷酸化过程主要通过激酶进行磷酸化或磷酸酶进行去磷酸化来动态调控。双组分系统(two-component system,TCS)是细菌中第一个确认的磷酸化调控系统,对细菌存活、代谢和毒力都起着至关重要的作用10。TCS主要由结合在膜上的信号感受器和位于胞质中的反应调节蛋白组成。信号感受器通常为一种组氨酸激酶,在感受到外界环境压力后会结合ATP使His残基发生自磷酸化,然后将His残基上的磷酸基团转
7、移到位于下游的反应调节蛋白的Asp残基上。磷酸化的反应调节蛋白被激活,进而通过其DNA结合结构域调控下游基因的表达。除上述激酶介导的磷酸化修饰外,细菌中也存在着不依赖于激酶的磷酸化修饰。McCleary 等11发现细菌中的CheY、PhoB等蛋白在与乙酰磷酸(acetyl phosphate,AcP)进行体外共孵育时也会产生磷酸化修饰。1.2 乙酰化蛋白质乙酰化是最常见的酰化修饰类型,其通常是在受体蛋白赖氨酸(Lys,K)残基上加入乙酰基团12,主要包括N乙酰化和N乙酰化两种修饰方式13-14。N乙酰化是将乙酰辅酶A(acetyl-coenzyme A,Ac-CoA)的乙酰基不可逆地转移到受体
8、蛋白N端的氨基上,主要存在于真核生物中,该修饰通常与蛋白质的降解相关15。N乙酰化则是将Ac-CoA转移到受体蛋白链中Lys的氨基上进行可逆修饰,通常与蛋白质的活性和稳定性相关16,在真核与原核生物中都广泛存在。本文主要讨论的是N乙酰化。细菌中的N乙酰化主要包括酶促与非酶促两种形式12,其中酶促的乙酰化修饰主要由赖氨酸乙酰基转移酶(lysine acetyltransferase,KAT)调控。在细菌中最主要的KAT是Gcn5相关的N-乙酰转移酶(Gcn5-related N-acetyltransferase,GNAT)家族17-18。GNAT家族的KAT首先使Lys残基去质子化,再将Ac-
9、CoA供体上的乙酰基转移到Lys残基上。非酶促途径的乙酰化修饰则主要使用AcP作为乙酰基供体以不依赖酶催化的方式进行,在许多细菌中,AcP浓度与乙酰化水平呈正相关19-21。1.3 甲基化蛋白质的甲基化是指在甲基转移酶催化下,甲基基团由S-腺苷基甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)转移至受体蛋白氨基酸残基的过程。可发生甲基化修饰的氨基酸残基常见于Lys、Arg、His和Asp22,另外在组蛋白H2A的谷氨酰胺(Gln,Q)上也曾被报道可发生甲基化修饰23。细菌中的蛋白质甲基化修饰依据功能差异可以分为N-甲基化24与O-甲基化25。N-甲基化常发生在Lys、Arg和Gln
10、残基上,并且1个氨基酸残基可结合多个甲基基团(例如Lys最多可以结合3个甲基基团),主要影响细菌与宿主的相互作用24,26;O-甲基化只发生在谷氨酸(Glu)侧链羧基上,主要在细菌的趋化性蛋白上被发现25。1.4 糖基化蛋白质糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白质上特定的氨基酸残基共价结合的过程。由于低聚糖侧链结构的多样性,糖基化修饰的多样性是其他PTM无法比拟的27。糖基化会影响蛋白质的结构、稳定性和溶解度等,对细胞识别、黏附和定位等过程至关重要28。蛋白质糖基化在细菌中广泛存在29-30。根据糖苷键的不同,糖基化主要分为N-糖基化和O-糖基化,N-糖基化常发生在天冬酰胺(Asn,N)的酰胺基N
11、上,而O-糖基化则常发生在Ser/Thr的羟氧基O上。细菌中研究最为清楚的糖基化修饰系统为空肠弯曲杆菌的Pgl途径29。Pgl途径中最主要的酶是寡糖转移酶PglB,这是一种膜蛋白,其N-糖基化位点特征序列为Asp-Glu-Y-Asn-X-Ser/Thr,可以将低聚糖从脂质载体十一烯基焦磷酸转移到底物蛋白的Asp残基上31-32。141Chinese Journal of Nature 2024 Vol.46 No.2 REVIEW ARTICLE2024 年 46 卷 2 期 专题综述 1.5 类泛素化泛素(ubiquitin,Ub)是一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白质,包含7个保守的Lys
12、位点(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)。Ub可以与靶蛋白上的Lys残基共价结合形成泛素化修饰33。泛素化修饰最早在真核生物中被发现,通过泛素-蛋白酶体途径调控蛋白质的降解,需要被降解的蛋白质先进行泛素化修饰,进而被蛋白酶体识别并降解34。直到2008年细菌中才被发现存在有类泛素化修饰。Pearce等35在结核分枝杆菌中发现了一种功能上与泛素化相关的小修饰蛋白,命名为原核泛素样蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)。Pup是一种6070个氨基酸的无序蛋白质,可以通过其C端Glu残基连接到靶蛋白的Lys侧链上,该过程称为原核生物类
13、泛素化修饰(Pupylation)。Pupylation主要由单连接酶PafA和单脱肽酶Dop调控35-36,与结核分枝杆菌的一氧化氮耐受性、铜耐受性以及热休克反应密切相关37。1.6 乳酸化乳酸化修饰最早是由赵英明及其合作者38于2019年发现的存在于组蛋白上的一种PTM。随着研究的进展,研究人员发现组蛋白乳酸化修饰在炎症、细胞分化和癌症发生发展中都发挥着重要作用39。随后,Dong等人40在2022年首次报道了大肠杆菌中存在广泛的乳酸化修饰,并鉴定出YiaC是赖氨酸乳酸化转移酶,去乙酰化酶CobB同时发挥着去乳酸化酶的功能。CobB通过去除丙酮酸激酶PykF K382的乳酸化修饰,增强Py
14、kF的酶活性,从而促进糖酵解,进而影响大肠杆菌的生长状态40。这提示我们,乳酸化修饰在细菌代谢中发挥着重要作用。2 蛋白质翻译后修饰对细菌致病力的影响2.1 蛋白质翻译后修饰调控细菌毒力2.1.1 双组分调控系统PhoP/PhoQ的PTM调控网络PhoP/PhoQ是细菌中保守的双组分调控系统,能够应答宿主体内多种环境信号41-43,对许多病原菌的毒力至关重要44。沙门菌中的PhoQ可以在感知外界的低镁离子浓度42、低pH43和抗菌肽45等条件后自磷酸化,随后将磷酸基团转移到保守的PhoP D52上活化PhoP,进而调节沙门菌约9%基因的表达46。但是,最近的研究发现,除了D52磷酸化以外,Ph
15、oP还存在其他复杂的PTM网络调控(图1(a)。沙门菌PhoP可以在三个Lys残基上乙酰化。任洁等人研究发现PhoP K201可以被Pat乙酰化和CobB去乙酰化47。位于PhoP的C端DNA结合结构域的K201发生乙酰化会抑制PhoP与下游基因启动子的结合,从而抑制了沙门菌毒力。在小鼠感染模型中,野生型和K201R(模拟去乙酰化)具有相同的毒力,而K201Q(模拟乙酰化)毒力明显减弱47。还有研究发现,PhoP K88和K102可以被AcP非酶乙酰化修饰。K88的乙酰化会降低PhoP二聚化,从而抑制其DNA结合和PhoP激活下游基因转录的能力48。K102乙酰化水平在添加能提高AcP浓度的碳
16、源(葡萄糖和乙酸盐)时明显增强,而在PhoP激活条件(低镁和pH=5.0)时反而降低。进一步研究发现,当K102乙酰化时,D52处的PhoP磷酸化受到抑制49,PhoP的乙酰化和磷酸化之间存在串扰。苏杨等人的研究50还发现PhoP上还存在着广泛的甲基化修饰位点,包括E8/D9、E107/E108和R112,这些位点的甲基化会抑制PhoP活性但增加其稳定性。当PhoP、SAM与CheR体外共孵育时,质谱检测到PhoP R112位点的甲基化水平显著升高,这表明PhoP R112位点的甲基化修饰是由CheR蛋白介导的。总之,PhoP上存在多个位点的磷酸化、乙酰化、甲基化修饰,这些PTM在不同条件下发
17、挥不同的作用,共同调控着PhoP的活性,使沙门菌能够适应不同的环境压力。2.1.2 乙酰化调控转录调控因子HilD稳定性与活性沙门菌具有两套型分泌系统,感染宿主时可分泌效应蛋白帮助其入侵和存活51,其中第一套型分泌系统由沙门菌毒力岛-1 142Chinese Journal of Nature 2024 Vol.46 No.2 REVIEW ARTICLE(Salmonella pathogenicity island 1,SPI-1)编码,与沙门菌入侵细胞相关,SPI-1的表达主要受转录因子HilD的正调控52。桑昱等人53发现,沙门菌敲除乙酰基转移酶pat后,SPI-1编码基因表达明显下调
18、,感染小鼠时毒力显著降低,表明乙酰化修饰能影响沙门菌毒力。进一步体外实验证明HilD可作为Pat的底物被乙酰化,乙酰化可有助于HilD避免被Lon蛋白酶降解,从而增加蛋白稳定性(图1(b)53。质谱分析发现HilD的乙酰化修饰位于K297上,而K297位于HilD的DNA结合结构域,K297乙酰化会抑制HilD与下游基因的结合,最终导致沙门菌毒力降低54。HilD的乙酰化修饰使沙门菌HilD的稳定性和活性维持在合适的水平,对沙门菌毒力的调控至关重要。2.2 蛋白质翻译后修饰调控细菌适应力2.2.1 细菌趋化性细菌趋化性是指有运动能力的细菌对物质化学浓度梯度做出的反应,使细菌趋向有益刺激,逃避有
19、害刺激。趋化性信号通路广泛分布在各种致病细菌中,与其定植与侵袭显著图1 PTM在细菌毒力与趋化性中的作用。(a)PhoP活性的翻译后修饰调控网络;(b)HilD乙酰化调控SPI-1表达;(c)细菌趋化性的PTM调控网络143Chinese Journal of Nature 2024 Vol.46 No.2 REVIEW ARTICLE2024 年 46 卷 2 期 专题综述 相关55。大肠杆菌膜上的甲基受体趋化性蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein,MCP)能感受外界环境信号刺激,然后与组氨酸自磷酸化激酶CheA结合,CheA激活下游的CheY和Che
20、B。磷酸化的CheY会与下游的鞭毛转换蛋白FliM结合,使细菌运动方向由逆时针转变为顺时针56;磷酸化的CheB介导MCP的去甲基化,使MCP与CheA的结合减弱,CheY磷酸化减弱,细菌运动方向恢复55。Barak等57还发现CheY的C端存在许多乙酰化修饰位点(K91、K92、K109、K119、K122和K126),其中部分位点直接参与CheY与FliM的结合58。CheY的磷酸化修饰和乙酰化修饰是相互联系的。CheY的磷酸化与乙酰化呈负相关,只有非乙酰化的CheY能够与CheA结合磷酸化并与下游FliM结合(图1(c)57。细菌中存在未修饰、磷酸化和乙酰化三种状态的CheY,其比例由细
21、胞代谢状态调控,细菌可以通过此方式把代谢与细菌的趋化性联系起来59。2.2.2 抗生素耐药性随着抗生素的使用,病原菌不断出现新的耐药性,耐药性细菌所致的感染已成为当今人类健康和生命的主要威胁之一60。细菌的耐药性主要取决于多种内在和获得性抗生素耐药机制,包括产生抗菌药灭活酶、改变抗菌药作用靶位、减少药物进入菌体内、主动外排药物和改变代谢途径等61-62。研究发现在脓肿分枝杆菌中,蛋白O-甘露糖基转移酶MAB_1122c缺失会导致细菌表面糖基化蛋白缺乏、细菌通透性增加,从而导致该缺失株对-内酰胺类抗生素和万古霉素的敏感性增强63。此外,在结核分枝杆菌中许多耐药基因,如RpoB、KatG、BlaC
22、、EthA和GyrAB均存在糖基化修饰,提示我们糖基化对这些耐药基因的功能可能存在重要的调控作用64。方祖业等人65通过定量乙酰化蛋白质组学发现,许多乙酰化蛋白参与大肠杆菌对于氨苄西林、卡那霉素和多黏菌素B的耐药调节。其中,丙酮酸激酶PykF K413乙酰化水平在以上3种抗生素耐药的大肠杆菌中均显著上调,PykF K413乙酰化降低了其酶活性,抑制了细菌的能量代谢从而增强其抗生素耐药性65,这提示我们细菌中的乙酰化可以通过调控代谢影响其耐药性。2.2.3 抗生素持久性不同于抗生素耐药性,细菌抗生素持久性(antibiotic persistence)是一种群体水平的现象,是指细菌在高浓度抗生素
23、处理时,会有小部分细菌虽然生长缓慢或不生长却仍能存活下来,且这群细菌并未产生耐药性的现象66。第一个被发现与持久性有关的蛋白是大肠杆菌的HipA,一种真核生物样丝氨酸/苏氨酸激酶67。HipA是II型细菌毒素-抗毒素系统中的一部分,抗毒素蛋白HipB可以通过转录抑制hipBA操纵子抑制HipA的毒性68。HipA可以磷酸化Glu-tRNA连接酶(glutamate-tRNA ligase,GltX),GltX S239的磷酸化会抑制其氨基酰化活性,这会进一步导致翻译停止,使细菌进入持久化状态69。HipBA同源蛋白在细菌中广泛存在,最近在大肠杆菌中鉴定出发挥类似HipBA的功能的HipBST系
24、统70以及7个新的HipA同源激酶家族71,提示我们PTM调控抗生素持久性的机制在细菌中可能广泛存在。2.3 细菌效应蛋白通过PTM操控宿主蛋白许多病原菌可以使用III型分泌系统将效应蛋白递送到宿主细胞中。效应蛋白在宿主细胞中可以操控其免疫和代谢等以创造有利于细菌存活的环境72。许多效应蛋白已经被证实其通过PTM调控宿主信号通路,促进其在细胞内的存活(图2)。因此,阐明细菌效应蛋白如何改变宿主信号传导以及靶向哪些宿主途径,对于了解细菌致病机制是必要的。2.3.1 磷酸化在真核生物的信号通路中,许多蛋白质的活性是通过其磷酸化状态来调控的73。因此,许多细菌进化出通过释放效应蛋白操纵宿主蛋白磷酸化
25、影响其活性,而实现自己入侵和存活的策144Chinese Journal of Nature 2024 Vol.46 No.2 REVIEW ARTICLE图2 细菌效应蛋白调控宿主PTM。细菌分泌的效应蛋白可以通过磷酸化、乙酰化、泛素化和ADP-核糖化等PTM,广泛调控宿主细胞中的Gq、SKAP2、Akt、MAPKK、NF-B等信号通路以及炎症小体/细胞焦亡相关通路,从而影响宿主细胞代谢、免疫和焦亡等,创造有利于细菌存活的环境略。第一个被发现具有激酶活性的效应蛋白是耶尔森菌的YpkA,YpkA激酶通过磷酸化Gq上的丝氨酸残基抑制Gq信号通路,影响宿主细胞肌动蛋白应力纤维形成74-76。耶尔森
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