高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 11 期2023 年 11 月Vol.45,No.11Nov.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202303033高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究武柳君1,2,卫东2,高广娟2,陈平2,刘思国2*,张跃灵2*(1.新疆农业大学 动物医学学院,新疆 乌鲁木齐 830052;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室/动物细菌病创新团队,黑龙江 哈尔滨 150069)
2、摘要:为鉴定猪链球菌()A型青霉素结合蛋白PBP1b在中的细胞定位,本研究经PCR扩增基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-片段替换了PSS-中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及PBP1b(GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-正确构建。以05ZYH33株和本实
3、验室前期构建的GFP-为对照,培养P-GFP-菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western blot检测P-GFP-菌株中GFP-PBP1b融合蛋白的表达水平,并与GFP-菌株进行比较;利用Alexa Fluor 633-WGA染色,经超高分辨显微镜观察GFP-和P-GFP-菌株形态及GFP-PBP1b融合蛋白在细胞中的定位。生长曲线结果显示,融合菌株GFP-和P-GFP-均正常生长;western blot结果 显示,GFP-和P-GFP-菌 株均能 够表 达GFP-PBP1b融合蛋白,但强启动子驱动的P-GFP-菌株中GFP-PBP1b蛋白表达量较GFP-菌株提高了
4、6倍(0.01);超高分辨显微镜观察结果显示,GFP-和P-GFP-菌株形态均正常,GFP-菌株中GFP荧光较弱,难以定位GFP-PBP1b,而P-GFP-菌株中GFP荧光较强,能够明显观察到融合蛋白GFP-PBP1b定位在的细胞横隔和两极。本研究通过构建高表达GFP-PBP1b融合蛋白的P-GFP-菌株首次观察到PBP1b在中的细胞定位,为进一步研究PBP1b在细胞壁肽聚糖合成中的作用奠定了基础。关键词:猪链球菌;荧光蛋白融合菌株;A型青霉素结合蛋白;PBP1b;细胞壁肽聚糖合成中图分类号:S852.61文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)11-1101-07Constru
5、ction offusion strain with enhancedexpression of GFP-PBP1b fusion protein and cellular localizationof PBP1b proteinWU Liu-jun1,2,WEI Dong2,GAO Guang-juan2,CHEN Ping2,LIU Si-guo2*,ZHANG Yue-ling2*(1.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.State Key Labora
6、tory for Animal Disease收稿日期:2023-03-31基金项目:国家重点研发计划(2021YFD1800401);国家自然科学基金(32172853);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610302022001)作者简介:武柳君(1999-),女,山西孝义人,硕士研究生,主要从事猪链球菌病方向研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding authorControl and Prevention,Division of Bacterial Diseases,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese A
7、cademy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract:In order to observe the cellular localization of class A penicillin-binding protein PBP1b in(),PCR was used to amplify the upstream and downstream sequences(UP and DN)of the fusion site of,thestrong promoter Penogene fragments,and thegene
8、fragments using indicated templates and primers.Then,the UP-Peno-GFP-DNfusion fragment was constructed by overlapping extended PCR amplification.This fragment was transformed into the PSS-intermediate strain containing reverse screening label by homologous recombination method,and screened on TSAS p
9、latecontaining 7%sucrose.Single colonies were identified using PCR and sequencing.PCR and the sequencing results confirmed thatthe PSS fragment in PSS-were replaced by the Peno-gene fragment in the obtained recombinant strain,indicating that therecombinantstrain P-GFP-fusing strong promoter Penoand
10、GFP was correctly constructed.The strain was designated asP-GFP-.Next,using the wild type(WT)and previously constructed GFP-strains as contrast,P-GFP-pbp1b strains wascultured and the growth curve was drawn with OD600nmvalues.Western blot was used to detect the expression level of GFP-PBP1bfusion pr
11、otein in P-GFP-,and compared it with that in GFP-.The morphology of GFP-and P-GFP-strains,as well as the cellular localization of the GFP-PBP1b fusion protein in both strains were observed using super resolution microscopeafter staing the cells with Alexa Fluor 633-WGA.The growth curves showed that
12、GFP-pbp1b and P-GFP-pbp1b strains grownormally.Western blot results showed that both GFP-and P-GFP-strains could express GFP-PBP1b fusion protein,butthe expression of GFP-PBP1b in P-GFP-strain driven by strong promoter was 6 times higher than that of GFP-strain(0.01).Super resolution microscopic obs
13、ervations showed that the cell shape of both GFP-and P-GFP-strainsappeared to be as normal as the WT strain.The fluorescence signal in the GFP-strain was too weak to locate GFP-PBP1b.Incontrast,the P-GFP-strain exhibited strong fluorescence signal,allowing easily localization of GFP-PBP1b at the cel
14、l septumand cell poles.This study firstly locallizted PBP1b protein inby constructing gene-fusion strain with enhanced expression ofthe fusion protein GFP-PBP1b,facilitating the further study of PBP1b protein function in cell wall peptidoglycan synthesis of.Key words:;fluorescent protein fusion stra
15、in;penicillin-binding protein;PBP1b;cell wall peptidoglycansynthesis猪链球菌()是一种重要的人兽共患传染病病原体,临床上常与大肠杆菌()、葡萄球菌等其他病原菌混合感染1-2,该菌能够引起猪的多种疾病,如脑膜炎、关节炎、败血症等,给全球养猪业造成重大的经济损失,该菌也会导致人的类似疾病和死亡,也对人类公共健康构成威胁3-5。由于抗生素在养猪业中长期和不规范使用,近年来的耐药性日益严重,猪链球菌病的防控形势日益严峻,亟需开发新的药物靶标。细菌胞壁肽聚糖是维持细菌形态和生长的关键因素,其合成途径是临床应用抗生素的主要靶点6。由于其对
16、细菌生长极其重要,研究细菌胞壁肽聚糖合成途径中相关酶类并阐释其功能和作用机制,对开发新的抗菌药物靶标具有重要意义。青霉素结合蛋白(Penicillin-binding protein,PBP)是细菌胞壁肽聚糖合成途径中的关键酶类7,参与细菌胞壁肽聚糖合成的最后阶段8,对细菌胞壁肽聚糖的形成、成熟和功能发挥决定性作用9。2020年,Straume等研究显示,的A型PBP以未知的方式修饰肽聚糖,使其转变成与新生肽聚糖不同但对细胞壁合成则为必要的结构10;Vigouroux等证实肺炎链球菌()的A型PBP,尤其是PBP1b能够修复细胞壁局部损伤,促进其生物完整性,对细胞壁的成熟和修复十分关键11-1
17、2。但目前相关研究较多集中于和,有关A型PBP的研究较少。PBP1b参与的细胞壁肽聚糖合成是一个在时间和空 间上受到精密调控的过程,因此观察鉴定PBP1b蛋白在中的细胞定位对研究其在体内的具体功能十分必要。为此,本实验室前期通中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1102过基于SacB反向筛选标记的无痕基因操作技术13,将绿色荧光蛋白基因()融合14-15至基因的上游,但是初步结果显示融合蛋白GFP-PBP1b表达量偏低,未观察到PBP1b蛋白的细胞定位。本研究进一步基于前期有关启动子的研究,将强启动子Peno融合至-基因的上游,用于提高-基因的表达水平,构建高表达GFP-PBP1b融合蛋
18、白的基因融合菌株,并观察到PBP1b蛋白在菌体内的定位,为进一步研究该蛋白在细胞壁合成中的功能奠定基础,对阐释细胞壁合成机制和开发新型抗菌药物具有重要意义。1材料与方法1.1主要实验材料05ZYH33菌株(以下简称WT菌株),为2005年中国四川流行分离株16;含表达GFP蛋白重组质粒的重组菌P-/pSET2、含正/反向筛选标记的中间菌株PSS-和利用SacB反向筛选法构建的融合与基因蛋白的融合菌株GFP-,均由本实验室前期构建并保存13。Tryptic Soy Broth(TSB)培养基和TrypticSoy Agar(TSA)培养基购自美国BD公司;Biosharp马血清购自哈尔滨市牧乐生
19、物试剂有限公司;蔗糖购自Sigma公司;信息肽GE9序列GNWGTWVEE17-18,由金斯瑞公司合成;HRP标记的山羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;兔源GAPDH多克隆抗体、兔源GFP多克隆抗体购自美国GeneTex公司;增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购自TIANGEN公司;Alexa Fluor 633-WGA(WheatGerm Agglutinin)和长效荧光封固剂(Prolong DiamondAntifade)购自美国Thermo Scientific公司。1.2引物的设计与合成参照05ZYH33株(CP000407)和GFP(ASL68970
20、)基因序列,利用PrimerPremier 5软件设计本研究所用引物(表1),引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。1.3P-GFP-菌株的构建与鉴定本研究涉及的WT示意图及PSS-、GFP-和P-GFP-菌株 构建 的示意 图如图 1所示。采 用 引 物UP-F/R和DN-F/R,以提取的WT菌株基因组DNA为模板,分别扩增目的基因融合位点的上下游片段UP和DN;采用引物Peno-F/R,以WT菌株基因组DNA为模板,经PCR扩增其强启动子序列Peno;采用引物GFP-F/R,以基因13为模板,扩增GFP基因片段。将获得的UP、DN、Peno和基因片段混合后作为模板,采用引物UP-F/R
21、,通过重叠延伸PCR,扩增构建GFP融合菌株的融合基因片段UP-Peno-GFP-DN。参考文献13,18的方法,将信息肽GE9(GN-WGTWVEE)与上述制备的UP-Peno-GFP-DN融合DNA片段混合,通过同源重组的方法转化至PSS-中间菌株13,并涂布含5%马血清和7%蔗糖的TSA培养基 平 板(TSAS+7%蔗 糖),37 过 夜 培 养,筛 选Peno-片段替代PSS-中间菌株PSS片段的菌株。挑取平板上的20个单菌落培养后,以WT菌株为对照,采用引物CFM-F/R进行PCR鉴定,大小正确的PCR产物由库美公司测序,序列完全正确的重组菌即 为 启 动 子 和 GFP 融 合 P
22、BP1b 的 菌 株,命 名 为P-GFP-菌株。注:粗体表示引物中引入的用于重叠延伸PCR扩增的基因序列,下划线表示12个氨基酸铰链的编码基因序列。Notes:Bold indicates the sequences introduced into the primers foroverlap-extension PCR,underlined indicates coding sequence of the12-aa linker.表1实验所用引物信息片段FragmentUPDNGFPPenoCFM引物PrimerUP-FUP-RDN-FDN-RGFP-FGFP-RPeno-FPeno-RC
23、FM-FCFM-R序列(5-3)Sequence(5-3)TAGGGTCACATTGTGCTTGTATTAACTCCTTATCGTTCCATTATGGCGACTAAATCAGATAAGAGCAGCCTGAGGAACAGTATGTCAAAAGGTGAAGAACTTGAATTCGCCAGAACCAGCAGCTGAACCAGCTGAACCTTTGTAAAGTTCGTCCATACCTGTTTCGCCAGAGGCTTATATATTACTCTCCTTTGAGTTTAAAGAGCTTGGCGTTTTGAAGGATGCTGGCAGAACCTA长度(bp)Size(bp)717708720197武柳君,等.高表
24、达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究第 11 期1103图1PSS-、GFP-和P-GFP-菌株示意图P-GFP-GFP-PSS-WTPeno1.4各菌株生长曲线的测定划线培养WT、GFP-和P-GFP-菌株,挑取各菌株单菌落,接种到含5%马血清的TSB液体培养基(TSBS),37 5%CO2过夜静置培养后,按1%将各菌液分别转接新鲜TSBS液体培养基,同样条件静置培养至OD600nm达0.10后,每隔30 min测定OD600nm值,根据各时间点OD600nm值绘制各菌株的生长曲线,分析各菌株生长特性。1.5GFP-和 P-GFP-菌 株 中 GFP
25、-PBP1b融合蛋白的western blot检测将WT、GFP-和P-GFP-菌株单菌落37 过夜活化后,按1%分别转接于新鲜TSBS培养基,37 5%CO2静置培养至OD600nm达1.0时,取20 mL菌液10 000 r/min离心1 min,PBS洗菌体沉淀3次,重悬于0.7 mLPBS中超声破碎后获得各菌株全菌蛋白,经超微量分光光度计测定浓度后将各菌株全 菌蛋白调整OD280nm一致后等量上样,分别以兔源GFP多克隆抗体(1颐10 000)和兔源GAPDH多克隆抗体(1颐10 000)为一抗,山羊抗兔IgG-HRP(1颐15 000)为二抗,使用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒对
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