不同碳源对耐热型解脂亚罗酵母生长的影响.pdf
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1、浙江科技学院学报,第 卷第期,年月J o u r n a l o fZ h e j i a n gU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g yV o l N o ,F e b d o i:/j i s s n 收稿日期:基金项目:国家级大学生创新创业训练计划项目();浙江科技学院科研启动基金项目(F L );浙江科技学院研究生课程建设项目(y j s k j )通信作者:黄俊(),男,河南省信阳人,教授,博士,主要从事蛋白质分子设计和定向进化及合成生物学研究.E m a i l:h u a n g j u n z u s
2、 t e d u c n.不同碳源对耐热型解脂亚罗酵母生长的影响夏凯,邵惠聪,陈珊珊,彭艳婷,黄俊,(浙江科技大学 生物与化学工程学院,杭州 ;浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,杭州 ;浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,杭州 )摘要:【目的】探索不同碳源对耐热型解脂亚罗酵母生长及产赤藓糖醇的影响,通过优化碳源组合提升耐热型解脂亚罗酵母的赤藓糖醇产量.【方法】分别以、条件下生长的解脂亚罗酵母C A 、解脂亚罗酵母HT 和解脂亚罗酵母HT 为研究对象,利用含有不同碳源的培养基进行培养.培养过程中每隔 h取样,采用酶标仪检测菌液在 n m处的光密度值(o p t i c a l d e
3、 n s i t y,O D ).培养液中赤藓糖醇和葡萄糖质量浓度采用高效液相色谱(H P L C)检测.【结果】菌株C A 能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、甘露醇、山梨醇、甘油、可溶性淀粉和大豆油脂等碳源,其中葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、甘油和大豆油脂为最优碳源;菌株HT 对除葡萄糖和果糖以外碳源的利用能力下降,而菌株HT 几乎不能利用除葡萄糖和大豆油脂以外的碳源;培养基中同时添加葡萄糖和另一种碳源对菌株C A 生长的影响较小,而同时添加葡萄糖和大豆油脂可明显促进菌株HT 和HT 的生长.此外,大豆油脂可显著提升菌株HT 和HT 的赤藓糖醇产量和得率,增
4、加量最高可达 左右.【结论】本研究结果为今后利用高温发酵生产赤藓糖醇提供了理论依据.关键词:解脂亚罗酵母;赤藓糖醇;耐热;发酵中图分类号:Q 文献标志码:A文章编号:()E f f e c t o fd i f f e r e n t c a r b o ns o u r c e so ng r o w t ho ft h e r m o r e s i s t a n tY a r r o w i al i p o l y t i c aX I AK a i,S HAO H u i c o n g,CHE NS h a n s h a n,P E NGY a n t i n g,HUANGJ
5、 u n,(S c h o o l o fB i o l o g i c a l a n dC h e m i c a lE n g i n e e r i n g,Z h e j i a n gU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,H a n g z h o u ,Z h e j i a n g,C h i n a;Z h e j i a n gP r o v i n c i a lK e yL a b o r a t o r yf o rC h e m i c a l a n dB i o l o g i c
6、 a lP r o c e s s i n gT e c h n o l o g yo fF a r mP r o d u c e,H a n g z h o u ,Z h e j i a n g,C h i n a;Z h e j i a n gP r o v i n c i a lC o l l a b o r a t i v e I n n o v a t i o nC e n t e ro fA g r i c u l t u r a lB i o l o g i c a lR e s o u r c e sB i o c h e m i c a lM a n u f a c t u
7、r i n g,H a n g z h o u ,Z h e j i a n g,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v eT h ee f f e c to fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e sw a s i n v e s t i g a t e do nt h eg r o w t ho ft h e r m o r e s i s t a n tY a r r o w i al i p o l y t i c aa n de r y t h r i t o ls y n t h e s i st
8、 oi m p r o v et h ep r o d u c t i o no fe r y t h r i t o l f r o mt h e r m o r e s i s t a n tY a r r o w i al i p o l y t i c ab yo p t i m i z i n gt h ec o m b i n a t i o no fc a r b o ns o u r c e s M e t h o dC u l t u r em e d i ac o n t a i n i n gd i f f e r e n t c a r b o ns o u r c e
9、 sw e r eu s e dt oc u l t i v a t e t h eYl i p o l y t i c aC A ,Yl i p o l y t i c aHT ,a n dYl i p o l y t i c aHT g r o w na t ,a n d,r e s p e c t i v e l y,d u r i n gw h i c ht h eo p t i c a ld e n s i t yo fc e l lc u l t u r ew a sd e t e c t e da taw a v el e n g t ho f n m(O D )w i t ha
10、 n i n t e r v a l o f hM e a n w h i l e,t h ec o n c e n t r a t i o n so f e r y t h r i t o la n dg l u c o s ew e r ea s s a y e db yu s i n gh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y(H P L C)R e s u l tS t r a i nC A i sa b l et ou s es u c hc a r b o ns o u r c e sa
11、sg l u c o s e,f r u c t o s e,g a l a c t o s e,a r a b i n o s e,x y l o s e,m a l t o s e,s u c r o s e,c e l l o b i o s e,m a n n i t o l,s o r b i t o l,g l y c e r o l,s o l u b l e s t a r c h,a n ds o y b e a no i l t og r o w,a m o n gw h i c hg l u c o s e,f r u c t o s e,m a n n i t o l,
12、g l y c e r o l,a n ds o y b e a no i l a r e t h eo p t i m a lc a r b o ns o u r c e s;t h eg r o w t ho fHT i s i n h i b i t e dw h e nu s i n gc a r b o ns o u r c e se x c e p t f o rg l u c o s ea n df r u c t o s e,w h i l e HT c a no n l yu s eg l u c o s ea n ds o y b e a no i lt os u p p
13、o r ti t sg r o w t h;t h ea d d i t i o no fg l u c o s ea n da n o t h e ro n ec a r b o ns o u r c ee x e r t sl i t t l ee f f e c to nt h eg r o w t ho fs t r a i nC A ,w h i l e t h ea d d i t i o no fg l u c o s ea n ds o y b e a no i lp r o m o t e st h eg r o w t ho fHT a n dHT o b v i o u
14、s l y I na d d i t i o n,t h ea d d i t i o no fs o y b e a no i lc a ns i g n i f i c a n t l yi m p r o v et h ee r y t h r i t o lp r o d u c t i o na n dy i e l db yHT a n dHT ,w i t ha ni n c r e a s ea sm u c ha s C o n c l u s i o nT h e s ef i n d i n g sc a np r o v i d eab a s i s f o r t
15、h ee r y t h r i t o l p r o d u c t i o nu s i n gh i g ht e m p e r a t u r e f e r m e n t a t i o n K e y w o r d s:Y a r r o w i al i p o l y t i c a;e r y t h r i t o l;t h e r m o r e s i s t a n t;f e r m e n t a t i o n赤藓糖醇(e r y t h r i t o l)化学名为(R,S)b u t a n e ,丁四醇,是一种白色、无味、不吸湿、无光学活性、热稳
16、定性好及易溶于水的四碳醇,广泛存在于水果、蔬菜和发酵食品中 .近年来,赤藓糖醇凭借其独特的理化性质如热值低、基本上不被人体代谢、稳定性高和食用不会引起肠道不适等受到广泛关注,市场需求量持续增长.据预测,到 年,其市场需求将达到 万t左右 .目前,赤藓糖醇主要由解脂亚罗酵母以葡萄糖和淀粉为原料进行发酵生产,存在生产成本高、冷却能耗大及生产效率低等问题.在国家“双碳”目标背景下,实现赤藓糖醇绿色生产势在必行.其中,如何有效降低生产成本一直备受关注.高温发酵能够实现糖化和发酵过程同步进行,并且降低冷却能耗及染菌倒灌风险,是降低生产成本的重要途径 .高温发酵需要使用能够耐受热胁迫的菌株,这与解脂亚罗酵
17、母最适生长温度()相悖.适应性进化可获得耐热型菌株,然而有研究表明高温胁迫可能会改变菌株的碳源利用谱.同时,在耐热型解脂亚罗酵母选育过程中,研究者发现热胁迫抑制细胞代谢合成赤藓糖醇.因此,如何提高细胞在高温条件下的赤藓糖醇合成能力值得探索.本课题组前期通过适应性实验室进化结合诱变选育,已获得能够在不同温度条件下生长的解脂亚罗酵母菌株.基于已有耐热型菌株,本研究旨在探明不同碳源对这些菌株生长及产赤藓糖醇的影响;并在此基础上,通过改变培养基中碳源组分提高赤藓糖醇产量,为今后高温发酵生产赤藓糖醇提供理论依据.材料与方法 材料与试剂赤藓糖醇高产菌种解脂亚罗酵母C A 由实验室选育获得,生长温度为,现保
18、藏于中国典型培养物保藏中心(C C T C C:M ).耐热型解脂亚罗酵母HT 和HT ,生长温度分别为 和,保藏于浙江科技学院生物与化学工程学院生物工程实验室.试验中所用化学试剂,如无特殊说明,均为分析纯,采购于生工生物工程(上海)股份有限公司及国药集团化学试剂有限公司.大豆油脂(金龙鱼)购买于本地灵峰生活超市(浙江益海嘉里食品工业有限公浙江科技学院学报第 卷司).碳源包括单糖(葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖)、二糖(麦芽糖、蔗糖和纤维二糖)、糖醇(甘露醇和山梨醇)及其他物质(甘油、可溶性淀粉和大豆油脂),均购于国药集团化学试剂有限公司.菌种活化培养基(y e a s t e x t
19、r a c tp e p t o n ed e x t r o s em e d i u m,Y P D):D 葡萄糖,质量浓度为 g/L;酵母浸出粉(o x o i d),质量浓度为 g/L;蛋白胨(o x o i d),质量浓度为g/L;N a C l,质量浓度为 g/L;KHP O,质量浓度为 g/L;培养基溶液的p H值为.固体培养基在液体培养基基础上添加质量浓度为 g/L的琼脂粉.试验中除碳源质量浓度变化外,其他培养基组分浓度保持不变.生长曲线测定过程中,碳源质量浓度统一为 g/L.赤藓糖醇发酵试验中,葡萄糖质量浓度改为 g/L.主要仪器全波长多功能酶标仪S p e c t r a
20、M a x i D(美谷分子仪器(上海)有限公司)、台式高速冷冻离心机A l l e g r a R(美国贝克曼库尔特有限公司)、智能恒温摇床Z Q Z Y A E(温度调节精度)(上海知楚仪器有限公司)、高效液相色谱仪e (美国沃特世公司)、Am i n e xH P X H分析柱(mm mm)(美国伯乐公司)、示差折光检测器 (美国沃特世公司).试验方法 生长曲线测定将甘油管保存的菌种C A 、HT 和HT ()在固体活化培养基中进行划线,之后分别置于、条件下静置培养d.挑取单菌落接种于m LY P D,r/m i n振荡培养至菌液光密度值(o p t i c a l d e n s i
21、t y,O D )为 .之后以体积分数的比例转接于 m L新鲜的待测试培养基中,分别置于、条件下,r/m i n振荡培养.培养过程中每隔 h取样测定菌液的O D .根据单一糖组分试验结果,测试混合碳源对不同菌株生长的影响.赤藓糖醇发酵试验挑取不同菌种的单菌落于m LY P D中进行过夜活化培养,之后以体积分数的比例接种于 m L发酵培养基中进行为期d的连续培养,培养温度分别为 (C A )、(HT )和 (HT ),转速为 r/m i n,发酵结束后取样测定发酵液中赤藓糖醇和葡萄糖的质量浓度.赤藓糖醇得率(g/g)获得的赤藓糖醇质量/消耗的葡萄糖质量.发酵培养基中碳源为葡萄糖或葡萄糖和大豆油脂
22、,大豆油脂质量浓度分别为 g/L(大豆油脂)和 g/L(大豆油脂).赤藓糖醇及葡萄糖检测产物和底物浓度测定采用高效液相色谱(H P L C),参照文献 所述.取样后,离心收集上清液(r/m i n,m i n),过 m滤膜,保存于 备用.检测条件为柱温,进样量为 L,流动相是摩尔浓度为 mm o l/L的硫酸,流速为 m L/m i n.数据统计分析本研究中所涉及生物学试验均重复次以上,数据差异显著性分析采用O r i g i n 软件中的ANO VA分析方法,选用B o n f e r r o n i多重比较,p 为两组数据间差异显著.图片处理采用软件A d o b eI l l u s t
23、 r a t o rC C .结果与讨论 解脂亚罗酵母在单一碳源培养基中的生长解脂亚罗酵母C A 在单一碳源培养基中的生长曲线如图所示.试验结果显示,在选取的种单糖、种二糖、种糖醇和种其他物质中,菌株C A 均能对它们进行利用.其中,相比半乳糖、阿拉伯糖和木糖等单糖,C A 更易利用果糖和葡萄糖(图(a).C A 在添加麦芽糖、蔗糖或纤维二糖的培养基中生长缓慢(图(b),说明菌株C A 对二糖的利用能力较弱.培养基中添加甘露醇可明显促进细胞第期夏凯,等:不同碳源对耐热型解脂亚罗酵母生长的影响的生长,而添加山梨醇时细胞的生长效果类似于在培养基中添加葡萄糖(图(c).此外,C A 对淀粉的利用能力
24、较弱,细胞生长缓慢,而添加大豆油脂可明显促进其细胞生长(图(d).图解脂亚罗酵母C A 的生长曲线F i g G r o w t hc u r v e so fY a r r o w i al i p o l y t i c aC A 已有研究表明,解脂亚罗酵母具有较广泛的底物谱,可利用烷烃、烯烃、有机酸、脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖、甘油和果糖等.类似地,本研究发现,解脂亚罗酵母C A 能很好地利用葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、甘油和大豆油脂进行生长.解脂亚罗酵母基因组中含有丰富的多糖水解酶编码基因,然而研究发现其并不能直接利用淀粉和纤维素等多糖,以及木糖和蔗糖 .这可能是相应酶未被激活.本研究
25、发现,菌株C A 能部分利用木糖、蔗糖、可溶性淀粉及纤维二糖进行生长,表明不同解脂亚罗酵母间存在差异.可见,菌株C A 具有较强的工业应用潜力.解脂亚罗酵母HT 在单一碳源培养基中的生长曲线如图所示.试验结果显示,菌株HT 利用果糖和葡萄糖生长时,生长速率低于菌株C A (图(a).菌株HT 对半乳糖和木糖的利用优于菌株C A .在二糖利用方面,菌株HT 利用纤维二糖和麦芽糖进行生长的情况类似菌株C A (图(b).此外,HT 对甘露醇和山梨醇的利用能力明显下降(图(c).类似现象同样出现在HT 对甘油和可溶性淀粉的利用上(图(d).另外,菌株HT 可利用大豆油脂进行较好的生长.菌株HT 是以
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