NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路参与化脓隐秘杆菌感染小鼠肝脏炎症反应的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45，No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202303006NLRP3炎症小体和NF-资B信号通路参与化脓隐秘杆菌感染小鼠肝脏炎症反应的研究李思琪1,2覮，秦嫘1,2覮，孟凡丹2，杨勇博2，王淑杰2*，蔡雪辉1,2*(1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069)摘要：为探究化脓隐秘杆菌()在肝脏中诱导炎症小体活化的机制，本研究以2伊106cfu/只腹腔注射化脓隐秘杆菌的小鼠为感染模型，分别于感染后不同时间采集小鼠肝脏组织，分别提取肝细胞RNA和蛋白质，将RNA反转录成cDNA作为模板，利用荧光定量PCR检测小鼠肝脏组织中NLRP-3、ASC、IL-18、IL-1茁和TNF-琢 mRNA的转录水平，同时通过western blot检测小鼠肝细胞中炎症小体信号通路蛋白NLRP-3、AIM2、ASC、Caspase-1、NLRP-1和细胞焦亡信号通路相关蛋白GSDMD-C、IL-18和IL-1茁的表达。结果显示，与对照组相比，感染化脓隐秘杆菌后1 d、2 d和7 d的小鼠肝组织内炎症小体信号通路蛋白基因及促炎细胞因子基因的转录水平均显著升高(0.05)；western blot检测感染后1 d、2 d、4 d和7 d的小鼠肝细胞蛋白，结果显示，与对照组相比，小鼠肝细胞内除NLRP-1的表达无差异外，其他炎症小体信号通路相关蛋白及促炎细胞因子表达量均显著或极显著升高(0.05，0.01)。上述结果证实化脓隐秘杆菌可诱导肝细胞中NLRP-3/ASC和AIM2/ASC炎症小体复合物的激活，继而促进Caspase-1的成熟与GSDMD的切割，引起肝细胞焦亡，导致大量促炎细胞因子释放。本研究进一步通过western blot检测化脓隐秘杆菌感染后1 d、2 d、4 d和7 d的小鼠肝细胞中NF-资B信号通路中p65和磷酸化p65蛋白(p-p65)的表达水平，结果显示，与对照组相比，p-p65蛋白的表达量显著升高(0.05)，表明NF-资B信号通路被激活。同时，本研究也对化脓隐秘杆菌感染小鼠后1 d、2 d、4 d和7 d采集的肝脏组织进行病理学观察，结果显示，与对照组织相比，肝细胞均发生变性及坏死。本研究证实在化脓隐秘杆菌感染的小鼠肝细胞内炎症小体和NF-资B信号通路参与了感染期间的炎症反应，为化脓隐秘杆菌引起肝脏炎症反应发生的机制研究提供参考依据。关键词：化脓隐秘杆菌；炎症小体；细胞焦亡；炎症反应中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)10-1054-07NLRP3 inflammasome and NF-资B signaling pathways areinvolved in the inflammatory response of mice liver infectedwithLI Si-qi1,2覮,QIN Lei1,2覮,MENG Fan-dan2,YANG Yong-bo2,WANG Shu-jie2*,CAI Xue-hui1,2*(1.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.State Key Laboratory of VeterinaryBiotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Heilongjiang,Harbin 150069,China)收稿日期：2022-03-06基金项目：国家自然科学基金面上项目(32273018)作者简介：李思琪(1997-)，女，吉林榆树人，硕士，主要从事猪免疫抑制性疾病临床免疫学秦嫘(1989-)，女，黑龙江齐齐哈尔人，博士，主要从事病原组织嗜性、混合感染协同致病机制研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authorAbstract:To investigate the mechanism of()inducing inflammasome activation in the liver,the mice were used as the infection model with intraperitoneally challenged withat a dose of 2伊106cfu/mouse.Bycollecting mouse liver tissue and extracting RNA and protein from hepatocytes,the RNA was reverse transcribed into cDNA as atemplate,the mRNA transcriptional levels of NLRP-3,ASC,IL-18,IL-1茁 and TNF-琢 were detected by qRT-PCR,and theinflammasome signaling pathway proteins NLRP-3,AIM-2,ASC and Caspase-1 and the pyroptosis signaling pathway proteinsGSDMD-C,IL-18 and IL-1茁,and the NF-资B signaling pathway proteins p65and p-p65 were detected by western blot.The resultsshowed that the mRNA transcriptional levels of inflammasome signaling pathway and pro-inflammatory cytokines in mice liverinfected withat days 1,2 and 7 were significantly increased(0.05)compared to the control group.Western blotwas used to detect the protein in liver tissue of mice on day 1,2,4 and 7 of infection,and it showed that compared with thecontrol group,there was no significant difference in the expression of NLRP-1,while the expression levels of other inflammasomesignaling pathway related proteins and pro-inflammatory cytokines significantly or extremely significantly increased(0.05,0.01).The results confirmed thatinduced the activation of NLRP-3/ASC and AIM2/ASC inflammasomes in hepatocytes,which promoted the maturation of Caspase-1 and the cleavage of GSDMD,causing pyroptosis of hepatocytes,resulting in therelease of a large number of pro-inflammatory cytokines.Further detection of expression levels of p65 and p-p65 in NF-资Bsignaling pathway in mouse hepatocytes at day 1,2,4,and 7 after infection withwas performed using western blot,and it showed a significant increase in p-p65 protein expression compared to the control group(0.05),indicating the activationof NF-资B signaling pathway.Meanwhile,histopathology examinations on the liver tissues of mice infected withatday 1,2,4 and 7 were also conducted,and the results showed that the hepatocytes all underwent degeneration and necrosiscompared with the control tissue.In conclusion,this study confirmed that inflammasome and NF-资B signaling pathways inhepatocytes of mice infected withare involved in the inflammatory response during infection,providing a theoreticalbasis for the research about the mechanism of liver inflammation caused by.Key words:;inflammasome;pyroptosis;inflammatory reaction化脓隐秘杆菌()是一种条件致病菌，可以感染猪、牛、羊等家畜，引起多种化脓性疾病，导致严重的经济损失1。该菌常定植在肺脏、肝脏、子宫和皮下组织等。当突破机体粘膜屏障侵入循环系统后，宿主继而产生一系列免疫反应，包括针对化脓隐秘杆菌感染的炎症反应2-3。因此，研究宿主对化脓隐秘杆菌的反应对于预和治疗化脓隐秘杆菌感染至关重要。肝脏作为重要的免疫器官，其丰富的自然杀伤细胞(NK细胞)和巨噬细胞(如Kupffer细胞)是肝内天然免疫的主要防线4。当病原侵入宿主后，肝脏免疫细胞中多种模式识别受体(Pattern recognition recep-tors，PRR)可通过识别特定的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)激 活特殊的信号通路，从而启动天然免疫应答，这在感染初期以及慢性化过程中发挥重要的作用5。PRR包括Toll样受体(TLR)、核苷酸寡聚化结构域(NOD)样 受体(NLR)、视 黄酸诱 导 基 因 I(RIG-I)样 受 体(RLR)、C型凝集素受体(CLR)和黑色素瘤缺失蛋白2(AIM2)样受体(ALR)。炎症小体是由胞浆内PRR参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分，炎症小体可以分为NOD样受体(Nod-like re-ceptors，NLR)家族和HIN-200蛋白家族两大类，因其在抵抗微生物感染的先天免疫反应中的关键作用而被熟知6。迄今为止，NLR家族主要有NLRP-1、NLRP-3、NLRC4、NLRP-6以及NLRP-12炎症小体，其 中 NLRP-3 是 研 究 最 广 泛 的 炎 症 小 体 之 一7。HIN-200家族蛋白则包括AIM2和IFN-16。半胱氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Cas-pase-1)在炎症小体中被激活，可以诱导促炎细胞因子IL-1茁和IL-18的加工和释放，以及诱导细胞焦亡8。先前有报道，猪链球菌感染可激活小鼠脾脏NLRP3炎症小体和MAPK炎症信号通路9。然而，化脓隐秘杆菌激活肝脏内炎症信号通路的研究鲜有报道。因此，本研究以小鼠为感染模型，检测感染后不同时间小鼠肝脏炎性因子，分析炎症信号通路中相关蛋白的表达，确定化脓隐秘杆菌激活肝脏内炎症信号通路类型，为化脓隐秘杆菌感染机制奠定基础。李思琪，等.NLRP3炎症小体和NF-资B信号通路参与化脓隐秘杆菌感染小鼠肝脏炎症反应的研究第 10 期10551材料与方法1.1菌株、实验动物及主要试剂化脓隐秘杆菌20121株由本实验室分离并保存。32只7周龄雌性野生型C57BL/6小鼠购自辽宁长生生物科技有限公司。兔抗NLRP-3、NLRP-1、IL-1茁、IL-18、茁-actin、凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)、p-p65和p65的多克隆抗体均购自ABclonal公司；AIM-2、GSDMD-C多克隆抗体购自Abcam公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PrimerScript 反转录酶购自TaKaRa公司；SYBR qPCR Master MIX购自诺唯赞公司；PMSF购自北京索莱宝科技有限公司；细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。1.2化脓隐秘杆菌感染小鼠实验将32只雌性野生型C57BL/6J小鼠随机分为2组，12只对照组小鼠腹腔注射0.2 mL TSB，20只感染组小鼠经腹腔以2伊106cfu/只注射化脓隐秘杆菌20121株，分别于感染后1 d、2 d、4 d和7 d剖杀每组小鼠并无菌采集肝脏组织样品，-80 保存备用。1.3感 染 小 鼠 肝 细 胞 中 NLRP-3、ASC、IL-18、IL-1茁和TNF-琢转录水平的qRT-PCR检测利用RNA提取试剂盒提取1.2中感染后第1 d、2 d和7 d采集的各组小鼠肝脏组织总RNA，反转录为cDNA后分别为模板，采用文献10中IL-1茁、IL-18、TNF-琢基因和内参基因茁-Actin的引物，以及文献11中NLRP-3和ASC的引物，通过qRT-PCR检测小鼠肝脏中炎症小体信号通路蛋白及炎性细胞因子mRNA的转录水平，实验以茁-actin基因为内参基因。每个样品设置3个重 复，采 用 2-驻驻CT法 计 算 NLRP-3、ASC、IL-18、IL-1茁和TNF-琢 mRNA的相对转录水平，驻驻CT=实验组(目的基因Ct-内参基因Ct)-对照组(目的基因Ct-内参基因Ct)。1.4感染小鼠肝细胞中炎症小体信号通路及焦亡通路相关蛋白表达水平的检测炎症小体在抗感染免疫中发挥重要作用12。为了确定化脓隐秘杆菌感染期间激活的炎症小体类型，本研究取1.2中感染后1 d、2 d、4 d和7 d采集的各组小鼠肝脏组织，经PBS匀浆后加入含有PMSF和罗氏蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，冰上孵育2 h，4 12 000 r/min离心10 min取上清，经BCA法测定蛋白质浓度后分别取等量蛋白，分 别 以 兔 源 NLRP-3、IL-1茁、IL-18、ASC、AIM2多克隆抗体(1颐500)，NLRP-1、GSDMD-C多克隆抗体(1颐1 000)和茁-actin多克隆抗体(1颐100 000)为一抗，IRDyeR800CW山羊抗兔IgG(1颐10 000)为二抗，odyssey红外扫膜系统对PVDF膜成像，经western blot检测炎症相关蛋白的表达情况。1.5感染小鼠肝细胞中NF-资B信号通路相关蛋白表达的检测NF-资B作为细胞内的核转录因子，参与机体的炎症反应13。核转录因子活化之后进入细胞核发挥功能，调节相关基因表达14。为探究化脓隐秘杆菌感染期间NF-资B信号通路是否参与小鼠肝细胞的炎症反应，本研究取1.4制备的感染后不同时间各组小鼠肝脏组织蛋白溶液，以兔源p-p65、p65多克隆抗体(1颐500)为一抗，IRDyeR800CW山羊抗兔IgG(1颐10 000，PBS稀释)为二抗，Odyssey红外扫膜系统对PVDF膜成像，经western blot检测感染小鼠肝脏中NF-资B信号通路蛋白表达情况。1.6肝脏组织病理学观察取1.2中感染后1 d、2 d、4 d和7 d采集的各组小鼠肝脏组织，参照文献15，经4%甲醛固定后石蜡包埋，切成6 mm8mm厚的切片，经苏木精和伊红(HE)染色后，于显微镜下观察肝脏组织的病理变化。1.7数据的统计学分析各组数据表示为平均值()依标准差()。采用GraphPad Prism统计学软件(版本8.0.1；GraphPad Software Inc.)进行数据分析，使用单因素方差分析和多重比较评估各组数据之间的差异性，0.05具有统计学意义。2结果2.1感 染 小 鼠 肝 细 胞 中 NLRP-3、ASC、IL-18、IL-1茁和TNF-琢转录水平的qRT-PCR检测结果采用qRT-PCR检测感染化脓隐秘杆菌感染后不同天数小鼠肝细胞中NLRP-3、ASC、IL-18、IL-1茁和TNF-琢基因转录水平，结果显示，各细胞因子与对照组相比，NLRP-3基因在感染后1 d 时转录水平极显著升高(0.01)，随后在第2 d和第7 d转录水平下降；ASC在感染后1 d，2 d和7 d的转录水平均显著升高(图1B，0.05)。与对照组和感染后1 d相比，促炎性细胞因子IL-18基因在感染后2 d和后7 d转录水平极显著升高(图1C，0.01)；TNF-琢、IL-1茁基因均在感染后1 d和2 d时转录水平极显著升高(图1D图1E，0.01)，而IL-1茁基因在感染后7 d时转录水平下降。以上结果表明，化脓隐秘杆菌可激活感染小中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1056A：炎症小体信号通路相关蛋白的western blot检测结果；BE：NLRP-3、AIM2、ASC和Caspase-1相对蛋白表达的灰度值分析A:Detection results of inflammasome signaling pathway-related proteins by western blot;B-E:Gray value analysis of relative protein expression of NLRP-3,AIM2,ASC,Caspase-1图2感染对小鼠肝细胞中炎症小体信号通路中相关蛋白表达水平的影响鼠肝脏组织中炎症小体信号通路相关蛋白和促进炎性因子mRNA转录水平升高。2.2感染小鼠肝细胞中炎症小体信号通路相关蛋白表达水平western blot检测结果采用western blot检测感染化脓隐秘杆菌后不同时间点小鼠肝细胞中炎症小体信号通路相关蛋白NLRP-3、NLRP-1、AIM2、ASC、Caspase-1的表达水平，结果显示，各蛋白与对照组相比，在感染后1 d，化脓隐秘杆菌可诱导肝细胞中NLRP-3蛋白的表达量显著升高(0.05)。随着感染时间的延长，化脓隐秘杆菌可诱导小鼠肝细胞中AIM2、ASC和Caspase-1蛋白的表达水平极显著升高(0.01)，而NLRP-1的表达无显著差异(数据未显示)(图2)。以上结果表明在化脓隐秘杆菌感染期间，NLRP-1炎症小体信号通路并未被激活，而NL-RP-3炎症小体和AIM2炎症小体信号通路在小鼠肝脏中被激活并诱导炎症。李思琪，等.NLRP3炎症小体和NF-资B信号通路参与化脓隐秘杆菌感染小鼠肝脏炎症反应的研究第 10 期1057*:0.05;*:0.01;*:0.001.The same as below.图1感染小鼠肝细胞中NLRP-3(A)、ASC(B)、IL-18(C)、IL-1茁(D)和TNF-琢(E)mRNA转录水平的qRT-PCR检测ABCDEABCDE118ku39ku22ku45ku42kuNLRP-3AIM2ASCCaspase-1茁-actinControl 1dpi2dpi4dpi7dpiControl 1dpi2dpi4dpi7dpiControl 1dpi2dpi4dpi7dpi1.20.80.401.20.80.401.00.80.60.40.200.30.20.10Control 1dpi2dpi4dpi7dpi151050Control 1dpi2dpi4dpi7dpiControl 1dpi2dpi7dpiControl 1dpi2dpi7dpiControl 1dpi2dpi7dpiControl 1dpi2dpi7dpiControl 1dpi2dpi7dpi10864202015105054321043210*2.3感染诱导肝细胞焦亡通路蛋白的检测结果采用western blot检测化脓隐秘杆菌感染对小鼠肝细胞中细胞焦亡信号通路相关蛋白GSDMD-C、IL-18和IL-1茁表达水平的影响。结果显示，各蛋白与对照组相比，在感染后1 d7 d，化脓隐秘杆菌诱导小鼠肝 细 胞 中 GSDMD-C 蛋 白 的 表 达 量 显 著 增 加(0.05)。同时，随着感染时间的延长，小鼠肝细胞中炎性因子IL-18和IL-1茁蛋白表达量均显著增加(0.05)(图3)。表明化脓隐秘杆菌诱导了肝细胞中GSDMD的切割，细胞发生焦亡后促进了IL-1茁和IL-18的释放，进一步表明化脓隐秘杆菌感染可诱导小鼠肝细胞发生细胞焦亡。2.4感染小鼠肝细胞中NF-资B信号通路蛋白表达水平western blot检测结果采用western blot检测化脓隐秘杆菌感染小鼠后不同时间点肝细胞中NF-资B信号通路相关蛋白的表达情况，结果显示，与对照组比较，化脓隐秘杆菌感染后p65蛋白表达水平极显著升高(0.001)，并在感染后4 d表达量达到峰值；同时，本研究中也检测了磷酸化的p65蛋白p-p65的表达情况，结果显示肝细胞中p-p65表达显著升高(0.05)(图4)。以上结果表明化脓隐秘杆菌感染后NF-资B信号通路被激活。2.5感染小鼠肝脏组织病理变化的观察对化脓隐秘杆菌感染小鼠后不同时间点采集肝脏组织制备病理切片进行组织病理学观察，结果显示，与对照组织相比，在感染后1 d肝细胞轻度变性，少量坏死；在感染后2 d、4 d和7 d，肝细胞均出现广泛变性，并部分坏死(图5)。表明化脓隐秘杆菌可以引起小鼠肝细胞发生炎症并坏死，进一步印证了本研究上述结果。A：NF-资B相关蛋白的western blot检测结果；BC：p65和p-p65相对蛋白表达的灰度值分析A:western blot detection results of NF-资B-related proteins;B-C:Gray value analysis of p65 and p-p65 relative protein expression图4感染后小鼠肝脏细胞NF-资B信号通路蛋白表达水平的western blot检测结果图5感染小鼠肝脏组织病理变化的观察65ku65ku42kup-p65p65茁-actinABCA：细胞焦亡相关蛋白的western blot检测结果；BD：GSDMD-C、IL-18和IL-1茁相对蛋白表达的灰度值分析A:Detection results of pyroptosis related proteins by western blot;B-D:Gray value analysis of relative protein expression of GSDMD-C,IL-18,IL-1茁图3感染对小鼠肝细胞中细胞焦亡相关蛋白表达水平的影响ABCD22ku18ku31ku42ku1.20.80.400.80.60.40.207dpi4dpi2dpi1dpiControl7dpi4dpi2dpi1dpiControlControl 1dpi2dpi4dpi 7dpiGSDMD-CIL-18IL-1茁茁-actinControl 1dpi 2dpi 4dpi 7dpi1.20.80.401.20.80.401.20.80.40Control 1dpi 2dpi 4dpi 7dpiControl 1dpi 2dpi 4dpi 7dpi7dpi4dpi2dpi1dpiCtr中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1058*2.6诱导小鼠肝脏中炎症小体信号通路和NF-资B信号通路激活机制综上所述，本研究证实了化脓隐秘杆菌感染可以诱导小鼠肝脏内NL-RP-3/ASC和AIM-2/ASC炎症小体复合物激活，引发肝细胞焦亡，从而引起大量促炎性细胞因子释放，同时NF-资B炎症信号通路的激活也促进了促炎性细胞因子释放，细胞焦亡和促炎性细胞因子TNF-琢的大量升高有可能与感染引起的肝细胞坏死有关，经归纳分析本研究绘制了诱导小鼠肝脏中炎症小体信号通路和NF-资B信号通路激活的机制(图6)。3讨论化脓隐秘杆菌感染通常伴有炎症，肝脏可能是其感染最主要的器官3。肝脏作为机体关键的一线免疫组织，在炎症早期的促进和消退中起关键作用16-17。炎症小体是一种复杂的蛋白质，在清除宿主体内侵入细菌方面发挥着关键作用，具有控制天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-1激活的能力18。炎症小体可以直接驱动Caspase-1的激活，进而促进炎性细胞因子IL-1茁和IL-18的加工和释放19-20，也可以引起细胞焦亡，即Gasdermin介导的程序性细胞坏死。IL-1茁和IL-18参与免疫调节，能招募并活化其他免疫细胞，继发产生一系列细胞因子21。本研究发现化脓隐秘杆菌感染小鼠肝脏中促炎性细胞因子IL-1茁、IL-18和TNF-琢的转录水平升高；同时，NLRP-3、AIM-2、ASC、Caspase-1和GSDMD-C蛋白表达量增加。NL-RP-3和AIM-2蛋白的表达在感染后均有升高，而NL-RP-1蛋白的表达在感染后无明显差异，这也确定了化脓隐秘杆菌感染期间激活的炎症小体信号通路为NLRP-3及AIM-2炎症小体信号通路。但不同的是NLRP-3在感染后1 d显著升高，而AIM-2是在感染后4 d和7 d显著升高，说明感染化脓隐秘杆菌后首先启动的是NLRP-3炎症小体的激活，随后NLRP-3/ASC炎症小体复合物促进pro-Caspase-1活化为Caspase-1，Caspase-1 切 割 GSDMD 为 GSDMD-C 和 GSDMD-N，GSDMD-N在细胞膜上打孔，引发细胞焦亡。机体的先天免疫系统通过炎症反应启动保护性免疫应答，促进对侵入病原体的清除22。有研究发现 虫 草 素 在 体 外 可 能 通 过 调 控 TLR4/NF-资B 和Nrf2/HO-1信号通路发挥抗炎和抗氧化活性来抑制弓形虫在小鼠腹腔巨噬细胞内的增殖和复制23。塞内卡 病 毒(SVA)感 染 再 经 IFN-琢 处 理 的 PK-15 细 胞(PK-15/SVA/IFN)转录显著差异miRNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt、NF-资B和肿瘤坏死因子(TNF)等抗病毒免疫相关信号通路24。核因子(NF-资B)信号通路是 经典 炎症 反 应 途 径，由 TLR诱 导 其 激 活 促 进pro-IL-1茁向成熟IL-1茁转化25，此外微生物产物和促炎细胞因子(如TNF-琢和IL-1茁)也会触发经典途径。总之NF-资B可以通过各种机制参与机体炎症的反馈控制，从而影响炎症的损伤程度26。有文献报道NF-资B对靶基因的诱导需要NF-资B蛋白(如p65)在其转录激活域内被各种激酶磷酸化27。本研究发现化脓隐秘杆菌能够诱导p65蛋白表达量增加，并能使p65蛋白磷酸化，表明NF-资B蛋白被激活，激活的NF-资B从细胞质迁移至细胞核内，作为一种核转录因子，参与介导激活炎性细胞因子IL-1茁和TNF-琢等的转录和表达。此外，本研究结果也显示NF-资B信号通路的关键蛋白p65的磷酸化水平的升高与促炎性细胞因子IL-1茁、TNF-琢的升高呈正相关，这表明NF-资B信号通路在化脓隐秘杆菌感染时被激活并发挥了促炎症作用，从而促进病原菌的消除。本研究在小鼠肝脏组织病理切片中观察到细胞坏死，结合本实验上述细胞焦亡的执行蛋白GSDMD的切割产物GSDMD-C表达增加的检测结果推测这有可能是细胞焦亡引起的坏死。焦亡细胞的细胞膜因被打孔而破裂，促炎性细胞因子被大量释放，引起一系列炎症反应。肝脏由于其独特的功能和解剖位置，一系列不同物质的代谢、毒性和炎症性损伤会导致肝损伤和相关疾病。已有研究表明肝脏损伤会导致机体活性氧和促炎细胞因子(包括TNF-琢和图6诱导小鼠肝脏中炎症小体信号通路和NF-资B信号通路激活机制的示意图李思琪，等.NLRP3炎症小体和NF-资B信号通路参与化脓隐秘杆菌感染小鼠肝脏炎症反应的研究第 10 期1059NecrocytosisPyroptosisGSDMD-NGSDMD-CGSDMDAIM2ASCASCNLRP3Pro-cas1Pro-cas1Active cas1pro-IL-18pro-IL-1茁pro-IL-1茁IL-1茁IL-18IL-6IL-6IL-6IL-1茁IL-18NF-资BNF-资BTNF-琢TNF-琢TNF-琢IL-1茁)的释放，且这些促炎因子大量分泌可以进一步引起宿主组织的损伤28。TNF-琢作为一种高度多效性细胞因子，可诱导多种生物学效应，如细胞增殖、代谢激活、炎症反应和细胞坏死29。本研究发现化脓隐秘杆菌感染诱导小鼠肝脏组织发生损伤，组织病理切片结果显示在感染期间肝细胞广泛变性，并随着感染时间的延长出现细胞坏死。本研究炎性相关因子检测结果也显示感染引起了肝组织内TNF-琢的升高，因此推测TNF-琢的升高也可能与化脓隐秘杆菌引起的肝坏死有关，具体的肝细胞坏死类型和机制还有待于进一步研究。本研究首次证实在化脓隐秘杆菌感染的小鼠肝细胞内炎症小体和NF-资B信号通路参与了感染期间的炎症反应，为化脓隐秘杆菌引起肝脏炎症反应发生机制的研究奠定实验基础。参考文献：YASSIN A F,HUPFER H,SIERING C,et al.Comparativechemotaxonomic and phylogenetic studies on the genus Ar-canobacterium Collins et al.1982 emend.Lehnen et al.2006:proposal for Trueperella gen.nov.and emended description ofthe genus Arcanobacterium J.Int J Syst Evol Microbiol,2011,61(Pt 6):1265-1274.LIANG HONG-MIN,WANG BING,WANG JUN-WEI,et al.Pyolysin of trueperella pyogenes induces pyroptosis and IL-1betarelease in murine macrophages through potassium/NLRP3/Cas-pase-1/Gasdermin D pathway J.Front Immunol,2022,13:832-858.JOST B H,BILLINGTON S J.Arcanobacterium pyogenes:molecular 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