雌性大鼠性早熟对糖脂代谢的影响.pdf
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1、第 45卷 第2期2024 年 3月Vol.45 No.2March 2024中山大学学报(医学科学版)JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)雌性大鼠性早熟对糖脂代谢的影响林小雅,黄宝江,张军,郭松,马华梅,李燕虹,杜敏联,陈秋莉(中山大学附属第一医院儿科,广东 广州 510080)摘要:【目的】探究雌性大鼠性早熟对糖代谢和脂代谢的影响。【方法】将60只两天龄的雌性大鼠随机分为性早熟组和正常组两组,分别在5天龄时给予达那唑(300 g/只)或溶剂大豆油进行皮下注射,从21天龄起每天观察大鼠的阴道开口状况。建模成功的两组按照阴道开口顺
2、序分别于阴道开口后3 d、7周龄和12周龄进行处死,处死前空腹 12 h。【方法】测量麻醉后的体重和鼻肛长,通过酶联免疫吸附试验测量葡萄糖、胰岛素、血脂、雌二醇、瘦素和脂联素的浓度,病理切片观察肾周脂肪、子宫和卵巢的变化。【结果】通过正常组和早熟组两组3个时间点对比,早熟组在阴道开口3 d时体质量和鼻肛长小于正常组,但是不影响后续生长发育,7周龄和12周龄时两组体质量和鼻肛长差异无统计学意义。两组的胰岛素浓度对比在阴道开口后3天内有统计学意义(P=0.001),早熟组存在高胰岛素血症,且早熟组此时的肾周脂肪细胞增多,在7和12周龄差异无统计学意义,两组3个时间点的雌二醇、瘦素和脂联素浓度差异均
3、无统计学意义,两组卵巢和子宫与体质量的比重差异无统计学意义。【结论】通过两组大鼠的对比,性早熟使机体提前跨越发育的时间窗,不能适应内环境的骤变,产生的一系列变化只是暂时性且可逆性,至成年期会恢复。关键词:性早熟;糖代谢;脂代谢;胰岛素抵抗;雌性大鼠中图分类号:R725.8 文献标志码:A 文章编号:1672-3554(2024)02-0233-10DOI:10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).20240305.005Effect of Precocious Puberty on Glucose and Lipid Metabolism in Femal
4、e RatsLIN Xiaoya,HUANG Baojiang,ZHANG Jun,GUO Song,MA Huamei,LI Yanhong,DU Minlian,CHEN Qiuli(Department of Pediatrics,The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China)Correspondence to:CHEN Qiuli;E-mail:Abstract:【Objective】To explore the effect of precocious puberty on
5、 glucose metabolism and lipid metabolism in female rats.【Methods】Sixty two-day-old female rats were randomly divided into 2 groups.When aged 5 days,the precocious puberty group and normal group were given a single subcutaneous injection of danazol and solvent soybean oil respectively.The vaginal ope
6、ning of rats was monitored from their 21 days of age.After 12 hours of fasting,all successful modeling rats were randomly executed within 3 days after vaginal opening,when aged 7 and 12 weeks.Then we measured the rats body weight and length,determined the concentrations of glucose,insulin,blood lipi
7、ds,estradiol,leptin and adiponectin with enzyme-linked immunosorbent assay and observed the pathological changes of perirenal fat,uterus and ovary.【Results】For body weight and length,rats in the precocious puberty group were smaller than those in the normal group within 3 days after vaginal opening,
8、but which did not affect their subsequent growth and development,and there was no 基础研究 收稿日期:2023-11-06 录用日期:2024-02-21基金项目:广东省科技创新战略专项资金(2018A030310266)作者简介:林小雅,第一作者,研究方向:儿童内分泌,性早熟,E-mail:;陈秋莉,通信作者,博士,副主任医师,E-mail:第45卷中山大学学报(医学科学版)significant difference between the two groups at 7 and 12 weeks of ag
9、e.Within 3 days after vaginal opening,insulin levels had significant difference between the two groups(P=0.001),the precocious group showed hyperinsulinemia and increased number of perirenal adipocytes.At three execution times,no significant difference was noted in estradiol,leptin and adiponectin l
10、evels between the two groups.The same was true in the ratios of ovary or uterus to body weight between the two groups.【Conclusions】Precocious puberty makes earlier onset of pubertal development and allows body maladaptation to the sudden changes of the internal environment.However,the changes due to
11、 precocious puberty are temporary and reversible,and they may become normal in adulthood.Key words:precocious puberty;glucose metabolism;lipid metabolism;insulin resistance;female ratJ SUN Yatsen Univ(Med Sci),2024,45(2):233-242性早熟是女孩在生殖年龄提前进入青春期的生理现象1,与正常发育女孩相比,性早熟女孩更容易出现体脂积聚的倾向,并且其体质指数标准分数(body ma
12、ss index standard deviation score,BMISDS)明显升高2。早初潮可能会增加成年期肥胖3、2型糖尿病4、高血压5、缺血性心脏病6和中风7的风险。早初潮的女性成年后心血管疾病的风险增加可能与儿童期脂肪积聚过多有关8-9,最近的研究还提示早熟女性在青春期和成年早期可能会积聚更多的脂肪10-11。然而,大部分相关研究都是回顾性研究,考虑到从青春期到成年期的时间跨度较大,影响因素众多,包括饮食习惯、遗传因素(特别是肥胖易感基因的差异)和环境因素等,这些人际差异都可能影响成年期的糖脂代谢或代谢综合征的发生率。动物实验具有控制多种因素的优势,除了研究因素即是否性早熟的不同
13、外,动物实验还能消除遗传背景的多样性、饮食结构和环境因素的干扰,从而更好地反映和解释性早熟对生理影响的程度。此外,动物实验还能够进一步探究性早熟伴随的内分泌-脂代谢调控异常对相关组织形态学的改变。然而,截至目前,尚未有相关动物实验报告关于性早熟对糖脂代谢影响的研究。因此,本研究旨在通过建立雌性SD大鼠性早熟模型,研究性早熟对大鼠青春期的早期、中后期以及成年期体脂积聚、糖代谢和脂代谢的影响。这将有助于更全面地理解性早熟的生理效应,为相关疾病的预防和治疗提供重要参考。1 材料与方法1.1实验动物本研究已获中山大学实验动物伦理委员会批准,批准编号为IACUC-2022-000982,符合伦理规范和法
14、规的要求。我们使用清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,这些动物由中山大学东校区动物实验中心 许可证号SCXK(粤)2021-0029 供应。正常SD大鼠是通过自然交配获得的,雌性大鼠产下幼仔后,我们选择了生后 2天龄的雌鼠,共分为 6窝,每只窝中有10只幼仔。这些大鼠在中山大学北校区动物实验中心的动物房 许可证号 SYXK(粤)2019-0209 中进行饲养。母鼠被提供标准饲料,可以自由进食,幼仔在生后3周龄时断乳。断乳后,每只幼鼠被分别安置在笼中,每个笼子中有4只幼鼠。这些幼鼠继续接受标准饲料,也是自由进食的。每周,我们测量幼鼠的体质量和鼻肛长,以监测它们的生长和发育情况。1.2
15、材料达那唑(Danazol):美国 LKT 公司。注射用大豆油:湖北盛天恒创生物科技有限责任公司;雌二醇:美国雅培公司,ARCHITECT Estradiol试剂盒。胰岛素:北京北方生物技术研究所,碘125I 胰岛素放射免疫分析药盒。血清胆固醇测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒:北京豪迈生物工程有限公司。高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒:日本积水医疗株式会社。瘦素:美国 RayBiotech 公司,Raybio Rat Leptin(OB)ELISA试剂盒。脂联素:Abno234第2期林小雅,等.雌性大鼠性早熟对糖脂代谢的影响va,Abnova Adipoq(Rat)EL
16、ISA试剂盒。1.3方法1.3.1 模型制备方法及分组 在雌性SD大鼠生后第5天,所有雌鼠按随机区组(同窝)设计,即同窝按随机数5只注射达那唑、5只注射溶剂大豆油最终分为2组(30只/组):正常发育对照组(以下简称C组或正常组):皮下注射精制大豆油0.1 mL;性早熟模型组(以下简称PM组或早熟组):皮下注射达那唑300 g/只12(达那唑溶于精制大豆油中,300 g/0.1 mL)。从第21天起每天观察阴道开口情况。早熟组中以小于正常组开口时间的-2SD纳入研究;若早熟组大鼠阴道开口超过正常组开口时间的-2SD,则视为造模失败者,弃去。两组中按窝号和开口顺序匹配的原则随机分为3批,分别于阴道
17、开口后 3 d 内(vaginal open day3,Vod3,青春早期)、满7周龄(青春中后期)和满12周龄(成年期)处死,每批至少包括16只大鼠,每组至少包括8只。1.3.2标本采集及处理所有大鼠在处死前一天禁食12 h,处死当天早上,称重和麻醉,测量麻醉后体质量和鼻肛长。取血立即测定葡萄糖浓度,及测定胰岛素、血脂(Chol、TG、HDL-c、LDL-c)、雌二醇、leptin、adiponectin。取血后立即处死、开腹,取出双肾周全部脂肪,称重;完整分离子宫卵巢,称重。将肾周脂肪、子宫卵巢置于40 g/L多聚甲醛固定。48 h后石蜡包埋,超薄切片(4 m)后HE 染色,显微镜下观察组
18、织结构。12 周龄大鼠处死前一天行OGTT(Oral Glucose Tolerance Test),禁食12 h 后开始实验,通过灌胃给予2 g/kg含水葡萄糖口服,分别于0,30,60,90,120 min剪尾取血检测微量血糖。1.3.3各指标检测及计算 Lee 指数(Lee index)=1 000体质量(g)-1/3/体长(cm);OGTT葡萄 糖 曲 线 下 面 积(glucose area under the curve,AUC)的计算:AUC=0.25(0 h血糖值)+0.5(0.5 h血糖值)+0.75(1 h血糖值)+0.5(2 h血糖值).胰岛素抵抗与胰岛敏感性评定指标:胰
19、岛素抵抗指数(homeostasis assessment model for insulin resistance,HOMA-IR)=胰岛素(U/mL)血糖(mmol/L)/22.5;胰岛素敏感指数(homeostasis assessment model for insulin sensitive index,HOMA-ISI)=100/胰 岛素(U/mL)血糖(mmol/L);肾周脂肪细胞直径测量:应用研究级正置荧光显微镜(BX 51),随机选取肾周脂肪 HE 染色切片的高倍视野(物镜40),应用Image-Pro Plus专业软件,测量每个视野中脂肪细胞最大径与最小径,计算其直径平均值
20、;同时计算相同单位面积内脂肪细胞数。所有数值均计算3个高倍视野取平均值。1.4统计方法所有定量数据经过正态性检验。符合正态分布的定量数据以均值标准差表示,均值之间的比较采用t检验。对于那些离散度较大,不符合正态分布的数据,采用对数转换后再次进行正态性检验。早熟组内两个变量之间的相关性分析采用Pearson相关分析进行。显著性水平为P0.05时,认为具有统计学意义。数据分析采用 SPSS 13.0(SPSS,version13.0 SPSS Inc,Chicago,IL,USA)。2 结 果2.1正常组和早熟组体格生长情况符合条件并纳入统计的正常组共30只,早熟组共25只(其中5只大鼠的阴道开口
21、时间超过正常组开口时间的-2SD,被排除,剩余 25 只进入早熟组)。研究期间,正常组和早熟组从生后第5 d开始至12周每周的身长、体质量和Lee指数均无统计学显著差异。两组生长曲线几乎完全重叠,表明性早熟对大鼠的体格生长没有明显影响。2.2阴道开口情况正常组的阴道开口时间是(36.133.45)(3142)d,早熟组阴道开口时间是(24.792.04)(2329)d,两组间有显著性差异(P0.001),造模成功。2.3两组于处死的3个时间点身长、体质量和Lee指数的比较两组在处死的3个时间点(Vod3、7周龄、12周龄)的身长、体质量和Lee指数如表1所示。由于早熟组的雌鼠性成熟较早,其阴道
22、开口时间也较早,因此Vod3时的雌鼠日龄显著小于正常组的雌鼠。在Vod3时,早熟组的身长、体质量和Lee指数也显著小于正常组。然而,这些差异并没有对后续的生235第45卷中山大学学报(医学科学版)长产生显著影响,两组在7周龄(青春中后期)和12周龄(成年期)的身长、体质量和Lee指数无统计学显著差异。2.4两组于处死的3个时间点雌二醇(E2)的比较两组在处死的3个时间点(Vod3、7周龄、12周龄)雌二醇的比较如表2所示。三个时间点两组间的雌二醇均无统计学显著差异,提示同一处死时间节点性发育状态接近。2.5两组于处死的3个时间点子宫卵巢的比较两组在处死的3个时间点(Vod3、7周龄、12周龄)
23、卵巢质量与体质量比值及子宫质量与体质量比值均无统计学显著差异,进一步说明两组在性发育程度上无差别。同一组别内7周龄与12周龄时子宫与体质量的比值较Vod3明显增加,提示随着年龄和性发育的进展,子宫相对体质量逐渐增大,而卵巢则相对变化不大(图1)。表1Vod3的身长、体质量和Lee指数Table 1Body length,weight and Lee index for VOD3 GroupsCPMt/t/ZPDay of death/d38.02.427.51.2-3.32b0.001Vod3-Ht/cm15.440.3612.230.72*-10.14a 0.001Vod3-Wt/kg105
24、.228.0150.8311.18*-11.02 0.001Vod3-Lee index305.54.4301.16.6*-1.63a0.143*P0.05 Normal group vs precocious group;a is t test;b is Wilcoxon rank sum test.Vod3:vaginal open day 3.Ht:body length,height;Wt:body weight,weight.There were 10 rats in the normal group and 8 rats in the precocious group.C:cont
25、rol group;PM:precocious puberty group.表2两组间3个处死时间雌二醇和Leptin的比较Table 2Comparison of estradiol and Leptin at three times of execution between the two groups GroupsCPMt/t/ZPVod3-E225.65.634.56.4-1.72b0.0877w-E257.829.240.36.4-1.13b0.27812w-E244.410.541.313.6-0.53a0.653Vod3-Leptin92.922.7144.9 128.8-0.1
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