出芽短梗霉菌株PA-2胁迫下藜qRT-PCR内参基因的筛选与验证.pdf

第 46 卷 第 2 期Vol.46 No.2 2024 年 2 月Feb.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland出芽短梗霉菌株 PA-2胁迫下藜 qRT-PCR内参基因的筛选与验证刘晓芳，程亮，郭青云*（青海大学农林科学院植物保护研究所/青海省农业有害生物综合治理重点实验室/农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海 西宁 810016）摘要：为筛选适合出芽短梗霉菌株 PA-2 胁迫下藜中稳定表达的内参基因，在转录组数据（NCBI 登录号为：SRA：SRR12674257）分析的基础上，以 PA-2 不同时间胁迫的藜叶片为材料，分析藜中 ACT-1、TUB-1、GAPDH、eEF1、eIF3、UBQ、PTB、COX10、UPL6、TIP41L、RAN-B1 和 IDH-5 等 12 个内参基因的表达水平，并利用 Ct、GeNorm、NormFinder、BestKeeper 及 RefFinder 分析候选内参基因的表达稳定性。结果表明，内参基因 COX10 是PA-2 不同时间胁迫下藜中最稳定的内参基因，最优组合是 COX10+eEF1。通过分析藜 ACC 基因的相对表达水平，验证了内参基因的可靠性，为今后杂草藜胁迫响应基因的表达分析提供了参考基因和理论依据。关键词：出芽短梗霉菌株 PA-2；qRT-PCR；藜；内参基因；表达稳定性中图分类号：S451 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）02-0048-09杂草是影响全球农作物可持续生产的最大生物因素之一1。藜（Chenopodium album）是一种极具竞争力的一年生世界性杂草，它的破坏性生长和化感作用对作物生长发育有很强的干扰作用，可导致作物大幅减产12。藜可以通过各种生存策略与其他植物争夺光照、水分、养分和空间，具有极强的环境适应力，同时它也是一些作物病虫害的替代宿主3。当前，可用于防治藜的除草剂种类有限，且化学除草剂的大量和长期使用不仅导致藜的抗药性增强，对非目标作物也有影响45。同时，化学除草剂会污染环境且损害公众健康，因此必须减少使用6。近年来，生物防治代替化学防治已成为国内外的研究趋势7，研究表明生物防治在替代化学农药和降低植物抗药性等方面具有巨大潜力8。其中，具有特异性强、安全性高、可开发资源丰富以及环境兼容性好等诸多优点的微生物除草剂，近年来逐渐成 为 国 内 外 研 究 的 重 点 和 热 点9。出 芽 短 梗 霉（Aureobasidium pullulans）菌株 PA-2 是从青海省海东市平安区杨树（Populus）病叶中分离出的病原真菌，PA-2 的安全性和致病性试验表明，其对青海省主栽作物如油菜（Brassica napus）和青稞(Hordeum vulgare var.coeleste)等没有危害，对多种阔叶杂草有较高的除草活性，尤其对藜的防效高达78.46%，表明PA-2有发展为藜的生物除草剂的潜力10。基因表达分析可为基因在应对外界环境压力时的表达水平提供基本证据，实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）因其快速、灵敏、准确和重复性好而被广泛应用于基因表达分析11。qRT-PCR 对核酸质量、引物特异性、反转录效率以及内参基因的选择等有非常严格的要求12。内参基因对基因相对表达水平测定结果有很大影响，因此，选择理想的内参基因是获得可靠结果的关键。理想的内参基因应不受实验参数的影响，在不同条件下保持稳定的表达水平13。为了获得更准确的结果，通常需要 1 个或多个内参基因来归一化 qRT-PCR 数据14。研究表明，在 NaCl和 PEG 胁迫下，3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）、-肌动蛋白基因（-actin）在藜中稳定表达15；藜中-微管蛋白基因（-tubulin）在高温、干旱和重金属胁迫下表达最稳定，18S rRNA 在低温和盐胁迫下稳定表达16。目前，关于出芽短梗霉菌株PA-2胁迫下藜内参基因的筛选未见报道。鉴于此，本研究基于藜转录组数据筛选出 ACT-1、TUB-1、GAPDH、eEF1、eIF3、UBQ、PTB、COX10、UPL6、TIP41L、RAN-B1、IDH-5 共 12 个候选内参基因，采用 qRT-PCR 技术扩增并用 3 个软件对候选内参基因的表达水平进行稳定性分析，利用 RefFinder在线DOI：10.16742/j.zgcdxb.20220404*通信作者，E-mail：收稿日期：2022-09-25；修回日期：2023-07-25基金项目：青海省自然科学基金面上项目（2022-ZJ-911）；国家自然科学基金项目（31760539）；青海省农业有害生物综合治理重点实验室项目（2022-ZJ-Y10）资助作者简介：刘晓芳（1995-），女，山西省吕梁人，硕士，主要从事杂草生物防治研究，E-mail：.48刘晓芳 程亮 郭青云 出芽短梗霉菌株 PA-2胁迫下藜 qRT-PCR内参基因的筛选与验证分析工具对以上软件分析结果进行了 PA-2 胁迫下候选内参基因的表达稳定性综合评价。同时，以藜乙酰辅酶 A 羧化酶（Acetyl-coenzyme A carboxylase）基因 ACCase 作为目标基因，对其表达模式进行标准化分析，以验证内参基因的可靠性，以期为进一步研究与藜胁迫相关基因的表达提供依据。1材料与方法1.1试验材料出芽短梗霉菌株PA-2的活化以及孢子液的制备参照文献 17。藜成熟种子采集于青海省西宁市二十里铺镇青海农科院试验田。筛选饱满且无病虫、大小均匀的种子，在 0.1%NaClO溶液中浸泡 5 min，然后用蒸馏水冲洗数次，最后用滤纸吸干剩余水分。将种子均匀播种在营养钵中，然后放入 16 h光照/8 h黑暗的光照培养箱内培养，温度设置为 25，待长至 34 对真叶时，将幼苗移栽于内径 20 cm 的花盆中，常规管理。幼苗长至 8 对真叶时进行 PA-2 胁迫。将含 106108孢子/mL的 PA-2孢子液喷施到藜植株上，每组 5盆，每盆 20 mL，以喷施无菌水作为空白对照。参照朱杰等18方法，分别在 PA-2侵染藜植株后的5个时间点（0、24、72、120、168 h）剪取藜叶作为待测试验样品（均设置 3 个生物学重复），置于液氮中速冻，并储存在80 的超低温冰箱中备用。1.2样品总 RNA提取及第一链 cDNA合成取样品 50100 mg，使用植物 RNA 提取试剂盒（Takara Bio，中国）提取藜总 RNA，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 纯度，用赛默飞微量核酸测定仪（NanoDrop One）检测RNA浓度和OD值，要求OD260/280在 1.82.1 之间。使用 FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix反转录合成第一链 cDNA，PCR体系与程序参考说明书，将cDNA置于20 保存。1.3候选内参基因引物设计与 qRT-PCR验证根据藜 SRA 数据库（登录号为 SRR12674257），筛选出 12个候选内参基因，利用软件 Primer Premier 5.0设计 qPCR 引物，且由上海生工合成引物，详见表 1。使用赛默飞世尔科技（中国）有限公司的 7500 Real-Time PCR 仪进行 qRT-PCR，嵌合荧光试剂使用 TaKaRa 的 TB Green 嵌合荧光试剂（RR820A）。扩 增 体 系 和 反 应 程 序 如 下：SYBR Primix TaqTM 12.5 L，正、反引物各 1 L，ddH2O 9.6 L，cDNA 0.5 L，ROX 0.4 L，总 体 系 25 L；反 应 程 序 为95 预变性 10 min，95 变性 15 s，退火 1 min，40个循环。反应结束后用凝胶电泳法检测扩增产物的大小，用熔解曲线（反应程序为 95 15 s，60 1 min，95 30 s，60 15 s）检测产物特异性，最后基于扩增结果制作内参基因的标准曲线，并计算相关系数和扩增效率。每个生物学样本做 3次技术重复。表 1候选内参基因的引物序列Table 1Primer sequence of candidate reference geneGenBank登录号GenBank accession No.OQ420593OQ420590OQ420599OQ420591OQ420592OQ420598OQ420601OQ420595OQ420596OQ420594OQ420600OQ420597基因描述Gene description肌动蛋白 actin-1基因微管蛋白-tubulin-1基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因真核翻译延伸因子翻译起始因子 3多聚泛素酶基因多聚吡啶结合蛋白基因细胞色素氧化酶亚基E3泛素蛋白连接酶 6基因液泡膜固有蛋白/水通道蛋白三磷酸鸟苷基因异柠檬酸脱氢酶基因基因缩写Gene abbreviationACT-1TUB-1GAPDHeEF1eIF3UBQPTBCOX10UPL6TIP41LRAN-B1IDH-5引物序列(5-3)Forward/reversed primer sequence(5-3)GTCCACAGAAAGTGCTTCTAAGAACAACTCCTCACCTTCTCATGATTGAGCGTCCTACCTACACTATGGTCTGGAACTCATTCACATCTTGGGCATTGACTTGGTTATCGAGCGTTACTGATGATGGTGTCTTCAGAGGAAGGGCGGAGATTAGCCTCAACAGCCTAGAACTTCGGTCACAGGCTTGTCAACGAAGGTTTCAGGAAGGTGCTGTCCTCATGCTTTGTAGATCTGGTGCTCCGTTTGAGTCTTCGCCTTAACATTGTCGCCACCTCAGAATCACGCATCACCGCAGAGGCATACGCAGGCATAGCCGTGACGATTATGCTGCTGGAGGCTGTGCCACCAATCGCTAGAGGGCTGTTACCTCTGGCTGTATTCTGTTCAATGGAGCCGCTGGATTCACGCCTCTCGCTGATGATGCTTGGTGATGGCGTGCTTATGAGACTTCGCAACCTGGCATCGGGACCTTTGTGCTTAGCCTTCACTTGCCTGTTCGTCGTAGCATGGTCACAGCACTTAGGCAACATTGGGGAGGGAGGTATTG49中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期1.4候选内参基因的表达稳定性分析采用CT、GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper四 种 不 同 的 分 析 方 法，确 定 12 个 候 选 内 参 基 因在 PA-2 不同时间胁迫下藜叶片中的表达稳定性。CT 法计算每个候选内参基因 CT 值标准差，标准差越小，基因的稳定性越高19。GeNorm用M值来表示内参基因的稳定性，M 值越小内参基因越稳定20。NormFinder 用稳定值 SV（Stability values）来表示内参基因的稳定性，SV 越小内参基因越稳定21。BestKeeper 用标准差（SD）、变异系数（CV）表示内参基因的稳定性，当 SDRAN-B1TIP41LeIF3IDH-5PTBUPL6UBQACT-1TUB-1GAPDH（表 3）。GeNorm 通过计算候选内参基因的成对变异值（V）确定最佳内参基因数量，V 的默认阈值为 0.15，如果 Vn/Vn+1eEF1 TIP41LRAN-B1eIF3PTBIDH-5UPL6UBQACT-1TUB-1GAPDH（表 3）。2.5BestKeeper软件分析BestKeeper 根据 CT 值计算标准差（SD）和变异系数（CV），进而评估候选内参基因的稳定性，SD 值和 CV 值越小，内参基因越稳定，SD1的内参基因通常被认为是不稳定表达基因。PA-2不同时间胁迫下，TIP41L 是最稳定的内参基因，其次是 RAN-B1，GAPDH 是最不稳定的内参基因。内参基因的稳定性从高到低依次为 TIP41LRAN-B1COX10eEF1 PTBIDH-5eIF3ACT-1UBQTUB-1UPL6GAPDH（表 3）。2.6RefFinder综合分析RefFinder综合分析表明，12个候选内参基因在PA-2不同时间胁迫下，在藜中的表达稳定性排序依次为：COX10eEF1TIP41LRAN-B1eIF3PTBIDH-5UPL6UBQACT-1TUB-1GAPDH（表 3）。COX10 是最稳定的内参基因，这一结果与 GeNorm 和 NormFinder分析的结果一致；图 3候选内参基因在藜中的表达水平Fig.3Expression level of candidate reference gene in C.album表 2候选内参基因的扩增信息Table 2Amplification information of candidate reference gene基因缩写Gene abbreviationACT-1TUB-1GAPDHeEF1eIF3UBQPTBCOX10UPL6TIP41LRAN-B1IDH-5产物大小(bp)Product size(bp)230128236172113114157195178179110123扩增效率（%）Efficiency(%)105.3890.17101.59100.76109.51102.41101.93105.33108.50105.14102.8197.11相关系数Correlation coefficient0.9950.9910.9950.9960.9900.9980.9920.9970.9910.9940.9900.993退火温度(C)Tm(C)57555760605761616060566052刘晓芳 程亮 郭青云 出芽短梗霉菌株 PA-2胁迫下藜 qRT-PCR内参基因的筛选与验证所有分析结果均表明 GAPDH 是最不稳定的内参基因。同时，结合 GeNorm 分析表明选择两个最稳定的内参基因组合可以准确地校正目标基因的表达，可见 COX10和 eEF1是最优内参组合。2.7内参基因稳定性的验证以 筛 选 出 的 稳 定 性 最 高 内 参 基 因 COX10、eEF1，最优组合COX10+eEF1以及稳定性最差的内参基因 GAPDH 为内参基因，分析在 PA-2不同时间胁迫下藜叶片 ACC 的相对表达量。与对照组相比，以 COX10 为内参时，ACC 表达量在 24、72、120、168 h 分别减少 15%、53%、61%、16%；以 COX10+eEF1 为内参时，ACC 表达量分别减少 8%、47%、51%、11%；以 eEF1为内参时，ACC 表达量在处理24 h 时增加 2%，在 72、120、168 h 分别减少 39%、38%、6%；以 GAPDH 为内参时，ACC 表达量在 24、72、120、168 h 分别增加 176%、151%、178%、120%。总之，在最佳内参和最优内参组合下，随处理时间的延长，ACC 表达量整体上均呈现先减少后增加的趋势且在处理120 h时达到最低；以GAPDH为内参时，ACC表达量整体上呈现先增加后减少再增加又减少的趋势。可以看出 GAPDH 作为内参，ACC 的表达模式和表达量与 COX10 和 COX10+eEF1 作内参时明显不同（图 5）。3讨论藜是一种一年生世界性杂草，它繁殖能力强、环境适应力强、土壤种子库中的持久性高、对非生物胁迫的耐受性强，可以侵扰多样作物，导致大豆（Glycine max）、小麦（Triticum aestivum）、大麦（Hordeum vulgare）与玉米（Zea mays）等作物产量损失超过 90%1。许多研究都集中在了解这种杂草生理生化以及基础代0.000.020.040.060.080.100.120.14V2/3V3/4V4/5V5/6V6/7V7/8V8/9V9/10V10/11 V11/12使用基因数量Number of reference gene used成对变异值Pairwise variation（V）图 4内参基因最优数量分析Fig.4Determination of the optimal number of reference gene表 3候选内参基因的稳定性分析Table 3Stability analysis of candidate reference gene排序Ranking123456789101112RefFinder分析内参基因Reference geneCOX10eEF1TIP41LRAN-B1eIF3PTBIDH-5UPL6UBQACT-1TUB-1GAPDHG值Geomean of values1.3162.0012.4493.1305.4395.9586.4818.6639.0109.45710.74111.996GeNorm 分析内参基因Reference geneCOX10eEF1RAN-B1TIP41LeIF3IDH-5PTBUPL6UBQACT-1TUB-1GAPDHM 值M value0.3210.3210.3900.4230.4940.5340.5710.6170.6740.7340.7830.851NormFinder分析内参基因Reference geneCOX10eEF1TIP41LRAN-B1eIF3PTBIDH-5UPL6UBQACT-1TUB-1GAPDH稳定值Stability value0.1600.1780.2040.2200.3550.3970.4110.4450.5310.5630.5930.731BestKeeper分析内参基因Reference geneTIP41LRAN-B1COX10eEF1PTBIDH-5eIF3ACT-1UBQTUB-1UPL6GAPDH标准差SD0.2730.3010.3100.3780.4760.4910.5010.6130.6240.6440.6460.873变异系数CV0.9511.2131.0921.3461.5891.7461.8402.0612.7032.5452.2714.10253中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期谢等方面，对于内参基因的筛选报道甚少。在本研究中，使用了 3个软件和 1个在线软件来评估候选内参基因表达的稳定性，不同的计算方法产生了不同的稳定基因。GeNorm 方法的一个缺点是它可能选择具有相似表达谱的共同调节基因，例如相同功能类的基因。当指定分组时，NormFinder会考虑组间和组内的变化来计算归一化因子，并消除对共调节基因值的人为选择21；但是，它不能排除样品之间的系统误差。BestKeeper需要输入 3 个以上候选内参基因的数据才能准确评估每个基因的稳定性22。基于不同的计算原理，以上 3 个统计程序的内参基因稳定性排名是不同的。RefFinder含有四种不同的统计方法（Ct、GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper），因此，研究中使用 RefFinder对候选内参基因表达稳定性进行综合排名。本 研 究 结 果 表 明，广 泛 使 用 的 藜 内 参 基 因GAPDH、TUB 或 ACT 在本试验条件下并不完全适用，而 COX10 的表达要稳定得多，COX10 是 PA-2不同时间胁迫藜叶片下最稳定的内参基因。已有研究报道，在 ABA 和盐胁迫下，COX 是姜（Zingiber officinale）最稳定的内参基因之一24；COX 在红薯（Ipomoea batatas）不同品种以及冷、干旱、盐和氧化胁迫下稳定表达25；COX 和 EF1 在菠菜（Spinacia oleracea）不同器官和非生物胁迫下稳定表达26；EF1在杂草黄花刺茄（Solanum rostratum）响应多种胁迫条件下稳定表达27。本研究表明，COX10和 eEF1 是PA-2 不同时间胁迫藜叶片的最优内参组合。总之，不存在完全通用的内参基因，在分析特定实验条件下目的基因的表达之前，对内参基因表达稳定性的评估是必不可少的。细胞膜在植物应对环境压力时起重要作用，脂肪酸是细胞膜的主要成分，其合成的关键限速酶是乙酰辅酶 A 羧化酶（ACCase），而 ACCase在调节植物应对环境胁迫的过程中具有重要作用。研究发现，小叶杨（Populus simonii）ACC1基因在干旱胁迫下表达增加，这表明 ACC1 可能在小叶杨的抗旱性中起重要作用28；在干旱胁迫条件下，ACC1在燕麦（Avena sativa）中表达上调，这表明 ACC1的表达可能与植物的抗逆性有关29。本研究中使用最优组合、最稳定和最不稳定的内参基因分析 ACC的表达水平，以最优组合为内参基因时，PA-2 不同时间胁迫下 ACC的表达模式呈现先减少后增加的趋势，这表明在 PA-2 胁迫下可能影响了 ACC 的表达；同时ACC在 PA-2胁迫 120 h时表达水平达到最低，推测这个时间点是 PA-2防除藜的关键点。4结论本研究首次在出芽短梗霉菌株 PA-2 胁迫下筛选了 12个候选内参基因，其中，COX10是最稳定的内参基因，COX10 和 eEF1 是最优内参基因组合，研究结果为后续开展杂草藜的胁迫响应基因的表达分析奠定了理论基础。参考文献（References）：1 Bajwa A A，Zulfiqar U，Sadia S，et al.A global perspective on the biology，impact and management of Chenopodium album and Chenopodium murale：two troublesome agricultural and environmental weeds J.Environmental Science and Pollution Research，2019，26：5357-5371.2 Ma X，Wu H，Jiang W，et al.Interference between redroot pigweed（Amaranthus retroflexus L.）and cotton（Gossypium hirsutum L.）：growth analysis J.PLoS 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