N1亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用.pdf

57-05D(网络首发时间：2 0 2 3-10-2 62024,54(02):157-161中国兽医科学2024,54(02)ChineseVeterinaryScienceDl:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0022中图分类号：S852.659.5文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96（2 0 2 4)0 2-0N1亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用张傲，王佳慧，王文佳，谭斌，张淑琴（中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112)摘要：为建立一种灵敏准确检测N1亚型猪流感病毒(SIV)的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法，本研究靶向N1亚型SIVNA基因的保守区设计特异性引物并构建质粒标准品，通过优化反应条件建立real-timePCR检测方法,对其特异性、敏感性、重复性进行评估,与常规PCR方法进行对比并应用于临床检测。结果显示，优化后所建方法的标准曲线为y=一3.32 9 7 x十36.8 8 1,R=0.9995,E=99.6%，质粒标准品的拷贝数与C值具有良好的线性关系。该方法特异性良好,与猪圆环病毒2 型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无交叉反应。最低检测量为1.0 3X10copies/uL,灵敏度为常规PCR的10 0 倍。重复性试验结果显示,组内与组间的变异系数均小于3.0%。所建方法对临床样品的检出率与鸡胚分离检测结果具有较高的符合率。上述结果表明，所建方法灵敏度高且特异性强，可应用于N1亚型SIV的临床样品检测与鉴定。关键词：猪流感病毒；N1亚型；实时荧光定量PCR；鉴别诊断Establishment and preliminary application of a real-time PCR methodfor detecting N1 subtype swine influenza virusZHANG Ao,WANG Jiahui,WANG Wenjia,TAN Bin,ZHANG Shuqin(Institute of Special Animal and Plant Sciences,Chinese Academy of A gricultural Sciences,Changchun 130112,China)Abstract:In order to establish a sensitive and accurate SYBR Green real-time PCR method for thedetection of N1 subtype SIV,specific primers were designed with the conserved region of the N1 subtypeSIV NA gene as target gene,and plasmid standards were constructed.A real-time PCR assay was developedby optimizing the reaction conditions and evaluating its specificity,sensitivity and reproducibility.This method was compared with conventional PCR method and applied to the detection of clinical samples.The results showed that the standard curve of the real-time PCR method was y=-3.329 7x+36.881 withan R value of 0.999 5,and the amplification efficiency was 99.6%.The results showed that there was alinear relationship between the number of plasmid copies and the Ct value.This method performed wellwith high specificity.There was no crossreaction with PCV2,CSFV,PRV and PRRSV.The minimum detectionamounts of plasmid standards was 1.03X10 copies/L,which was 100 times higher than that of the con-ventional PCR.The results of the repeatability experiment showed that the coefficient of variationbetween inter-groups and intra-groups were both less than 3.0%.The detection rate of the proposedmethod for clinical samples was in high concordance with the chicken embryo isolation assay.This收稿日期：2 0 2 3-0 7-2 5；修回日期：2 0 2 3-10-2 4基金项目：吉林省重点研发项目（2 0 2 2 0 2 0 2 0 58 NC）；吉林省创新创业人才项目（2 0 2 1Y034）作者简介：张傲（1996-），女，山西长治人，硕士生，研究方向为动物传染病病原学与流行病学，E-mail:。*通讯作者：张淑琴（197 8-),女，副研究员，博士，研究方向为动物病毒性传染病致病机制及防控技术，E-mail:。158第54卷中国兽医科学method has the advantages of high sensitivity and strong specificity,and can be applied to the detec-tion and identification of Nl subtype of SIV in clinical samples.Key words:swine influenza virus;Nl subtype;real-time PCR;differential diagnosis*Corresponding author:ZHANG Shuqin,E-mail:猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）为正黏病毒科、A型流感病毒属成员，可引起猪的急性、热性、高度传染性呼吸系统疾病。目前，世界范围内主要存在的SIV包括HIN1、H I N2 和H3N2亚型)。由于猪呼吸道黏膜上皮细胞表面同时存在禽流感病毒和人流感病毒的唾液酸受体，使得不同来源的流感病毒可以在猪体内进行基因重排，产生具有新的感染性、致病性及传播性的基因重排毒株2-3。猪流感病毒变异速度快，广泛流行于世界各地养殖场猪群中，在“禽一猪一人”的种间传播链中扮演着重要角色，不仅给全球养殖业带来了巨大的经济损失，并且对公共卫生造成了严重危害4-5。因此，建立一种灵敏有效的特异性检测方法不仅对SIV的预防和控制具有重要作用，更具有深远的公共卫生学意义。荧光定量PCR相较于常规PCR方法具有更高的灵敏性,且重复性好，检测速度快6 。本研究靶向N1亚型SIVNA基因的保守区设计特异性引物，建立一种能够检测并鉴定N1亚型SIV的real-timePCR方法，同时对其特异性、敏感性、重复性进行评估，为SIV早期诊断和流行病学调查提供参考。1材料与方法1.1病毒株HIN1亚型猪流感病毒（HIN1 SIV）、猪圆环病毒2 型(PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒(PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)均由中国农业科学院特产研究所动物保健团队保存1.2主要试剂与仪器Trizol购自莫纳（长春）生物科技有限公司。反转录试剂盒购自abm公司。2 XEasyTaqPCRSu-perMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。DNAMarker、T r a n s 1-T 1感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。胶回收试剂盒购自OMEGA公司。克隆载体pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司。2 XRealStarGreenFastMixture购自北京康润诚业生物科技有限公司。PCR仪购自Bio-Rad公司。荧光定量PCR仪购自赛默飞世尔科技（中国)有限公司。1.3引物设计与合成根据NCBI数据库中已有的N1亚型SIV序列，采用MEGAX进行比对分析，筛选出NA基因的保守区，利用PrimerPremier5设计特异性引物。上游引物序列为5-TGGATGGACGGAAACTGATAG-3,下游引物序列为5-ACGCCACAGAAAGAAATGC-TGC-3,扩增片段大小为2 10 bp,引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.4质粒标准品的制备采用Trizol试剂提取H1N1SIV总RNA，并参照abm反转录试剂盒操作步骤进行反转录。将获得的cDNA作为模板，使用合成的特异性引物进行PCR扩增。胶回收PCR产物并连接至pMD18-T载体,转化Trans1-T1感受态细胞。经菌液PCR初步鉴定后，送至库美生物有限公司测序验证。提取测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-N1-SIV,并使用分光光度计测定其浓度，按照拷贝数=质粒浓度（ng/L）10-96.0 2 10 2/6 6 0 质粒长度(bp)计算拷贝数。以此质粒作为质粒标准品，于一8 0 保存备用。1.5qPCR反应条件的优化及标准曲线的建立以1L质粒标准品pMD18T-N1-SIV为模板，对引物浓度、退火温度等反应条件进行优化，以确定最佳反应条件。将质粒标准品做10 倍稀释，获得浓度为1.0 310 copies/L1.0 310 c o p i e s/L的质粒标准品。以1.0 310 4copies/L1.0 310 9copies/L的质粒标准品为模板，按照优化条件进行检测，以质粒标准品拷贝数的对数值作为横坐标，C值为纵坐标建立标准曲线1.6特异性试验采用Trizol试剂提取病毒总RNA,并参照abm反转录试剂盒操作步骤进行反转录。以猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒(PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)的cDNA为模板，利用1.5优化好的反应条件进行qPCR，检验该方法的特异性。1.7敏感性试验以1L不同浓度(1.0 310 1.0 310 copies/L)的标准品质粒为模板进行敏感性试验，以确定该方法的最低检测量。同时进行常规PCR检测，分析两种方法的检测结果并比较其敏感性。常规PCR反应程序:9 53min;9530 s,532 0 s,7 2 2 0 s,159张第2 期傲等：N1亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用35个循环，7 2 终延伸5min。1.8重复性试验以1L3个浓度(1.0 310 5 1.0 310 copies/L)的标准品质粒为模板，分别进行组内和组间重复性试验，利用C值计算组内和组间变异系数，评估该方法的重复性和稳定性。1.9临床样品的检测对猪场30 份鼻拭子样品采用Trizol试剂提取RNA并反转录，分别利用建立的qPCR方法和常规PCR方法对临床样品进行检测，进行一致性分析。2结果2.1质粒标准品的制备提取SIV基因组并使用所设计的特异性引物进行PCR扩增,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,成功扩增出约2 10 bp的目的条带,大小与预期相符（图1)。将其连接到pMD18-T载体，构建质粒标准品pMD18T-N1-SIV，测序结果与目的基因一致。分光光度计测定质粒标准品浓度为198 ng/L，拷贝数为6.2 2 10 1copies/L。M1235 000 bp3.000 bp2.000 bp1 000 bp750 bp500 bp250bp100 bp图1阳性标准DNA模板的PCR扩增Figure 1 PCR amplification of positive standard DNA tem-plateM:DNA分子质量标准；1 3：标准品DNA模板。M:DL5000 DNA Marker;13:Standard DNA template.2.2qPCR反应条件的优化及标准曲线的建立对qPCR反应体系及反应条件进行优化，所建方法的最佳扩增体系：模板1L,10mol/L上、下游引物各 0.5 L,2XRealStar Green Fast Mixture 10 L,ddH,08L;扩增程序:952 min,9515s,6 0 20s,40个循环。优化后的熔解曲线为单一峰，Tm值为8 1（图2)，扩增曲线平滑呈指数增长（图3）。分别以1.0 310 4 1.0 310 copies/L质粒标准品作为模板，按照优化后的条件进行qPCR扩增（图4),以质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标、C值为纵坐标建立标准曲线（图5)。所建方法的标准曲线为y=-3.3297x+36.881,R2=0.9995,E=99.6%,表明质粒标准品的拷贝数与C值具有良好的线性关系。79000.069.000.059000.049000.039000.029.000.019000.09000.064.069.074.079.084.089.094.0温度/Temperature图2 卖荧光定量PCR熔解曲线Figure 2Dissociation curve of real-time PCR3.253.002.752.502.252.001.751.501.251.000.750.500.250.1994620246 810121416182022242628303234363840循环数Cycle图3荧光定量PCR反应体系优化后的扩增曲线Figure33 Amplification curve of reaction system optimiza-tionof real-timePCR3.253.002.752.502.252.001.751.501.251.000.750.501234560.25-0.2215180-0.25-0.50-0.75246810121416182022242628303234363840循环数Cycle图4荧光定量PCR扩增曲线Figure 4Amplification curve of real-time PCR16:质粒浓度分别为1.0 310%copies/L1.03104copies/L。1-6:Plasmid concentration of 1.03 X109 copies/L1.03 X104copies/L.2.3特异性试验用所建方法对PCV2、CSFV、PRV、PRRSV进行扩增，并以质粒标准品作为阳性对照，去离子水作为160第54卷中国兽医科学252015y=-3.329 7x+36.881R=0.999 510500246810质粒浓度(lg)Plasmid concentration图5卖荧光定量PCR标准曲线Figure5Standardcurveof real-timePCR阴性对照，评估所建方法的特异性。结果显示，仅有pMD18T-N1-SIV阳性标准品出现扩增曲线,其他病原样品均无特异性扩增（图6）。结果表明，所建立的qPCR方法特异性良好。3.002.752.502.252.001.7561.501.251.000.750.500.251-50.040246810121416182022242628303234363840循环数Cycle图6 特异性试验结果Figure6Specificity test results1:PCV2;2:CSFV;3:PRV；4:PRRSV;5：阴性对照；6:阳性对照1:PCV2;2:CSFV;3:PRV;4:PRRSV;5:Negative control;6:Positiveplasmid.2.4敏感性试验以不同浓度(1.0 310 copies/L1.0 310 9copies/L)的标准品质粒为模板分别进行实时荧光定量PCR和常规PCR的敏感性试验。结果显示,所建方法检测的最低拷贝数为1.0 310 copies/L（图7），常规PCR检测的最低拷贝数为1.0 310 3copies/L(图8)。上述结果表明,所建方法具有较高的灵敏度,其敏感度为常规PCR的10 0 倍。3.253.002.752.502.252.001.751.501.251.000.750.509876543210.250.199462002 468101214161820 22242628303234363840循环数Cycle图7 实实时荧光定量PCR敏感性结果Figure7Sensitivityof real-time PCR09:质粒浓度分别为1.0 310 copies/L1.0 310 c o p i e s/L。09:Plasmid concentration of 1.03 X10 copies/L-1.03 109copies/L.M123456789105 000 bp3 000 bp2.000 bp1 000bp750 bp500bp250 bp100 bp图8 常规PCR敏感性结果Figure 8 Sensitivity of conventional PCRMDNA分子质量标准；1 10：质粒浓度分别为1.0 3X10copies/L1.03X10copies/L。M:DL5000 DNA Marker;110:Plasmid concentration of 1.03 X109copies/L-1.03 X 10copies/L.2.5重复性试验选取1.0 3X105copies/L1.0 3X 10 c o p i e s/L这3个浓度的标准品质粒为模板，分别进行组内重复性试验和组间重复性试验，利用C值计算变异系数，评估所建方法的重复性及稳定性。结果显示,组内变异系数为0.444%1.0 11%,组间变异系数为0.319%0.7 49%，均小于3.0%（表1），表明所建方法具有较高的重复性和稳定性。表1重复性和稳定性试验结果Table 1 Repeatability and stability test results组内重复组间重复浓度/(copies:L-1)Inter-assay repeatabilityIntra-assayrepeatabilityConcentration平均数土标准差变异系数/%平均数土标准差变异系数/%Mean土SDCoefficient ofvariationMean土SDCoefficient of variation1.0310520.3670.1300.63920.3990.0870.4271.0310616.9240.0750.44416.9310.0540.3191.03X10713.4570.1371.01112.5630.0940.749胡弘博）161张傲等：N1亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用第2 期2.6临床样品的检测为了评估所建方法临床应用的可行性，采集吉林地区疑似猪流感发病猪鼻拭子样品共30 份，采用建立的qPCR方法对临床样品进行检测。结果显示，N1亚型SIV的检出率为40.0%（12/30），常规PCR的检出率约为33.3%（10/30）。经鸡胚盲传成功分离检测出12 份阳性，与所建方法具有较高的符合率。3讨论SIV可引起猪的高度传染性呼吸系统疾病,该病毒的传播给我国畜牧业造成了巨大的经济损失，并对人类构成潜在的大流行威胁。猪作为流感病毒的混合器，是产生大流行性流感病毒的重要宿主。自1918年以来，经典型H1N1SIV在猪群中传播并以重组的形式在人类中出现，导致了2 0 0 9年H1N1流感大流行7 。目前，我国主要流行的SIV包括欧亚类禽型HiN1（Eu r a s i a n a v i a n-li k e,EA H 1N1）类人型H3N2(Human-like H3N2,HLH3N2)及2 0 0 9大流行H1N1(Pandemic 2009 H1N1,Pdm 2009 H1N1)8-9)。我国的SIV监测数据显示，自2 0 16 年以来EAH1N1谱系的猪流感病毒一直在猪群中占主导地位，且其内部基因主要来源于Pdm09H1N110-11,具有潜在的大流行性风险。因此，需要加强对SIV的系统监测来防范潜在的流感病毒大流行。所以,建立一种特异、高效、准确的SIV检测方法，及时掌握SIV的生物学特性及流行情况，不仅对SIV的预防和控制具有重要作用，更具有深远的公共卫生学意义，本研究靶向N1亚型SIVNA基因的保守区设计特异性引物，并基于该引物建立了能够检测并区分N1亚型SIV的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法。该方法的最低检测量为1.0 3X10copies/L，灵敏度为常规PCR的10 0 倍。所建方法的特异性强且重复性高，与其他猪群常见病原无交叉反应，重复性试验中CV均小于3.0%。应用于临床样品检测，与鸡胚分离检测具有较高的符合率。综上表明，该方法具有临床应用价值，可作为SIV流行病学调查监测的有效工具，为SIV早期诊断和流行病学调查提供参考。参考文献(References)1BAUDON E,PEYRE M,PEIRIS M,et al.Epidemiologicalfeatures of influenza circulation in swine popu-lations:A systematic review and meta-analysisJ.PLoS One,2017,12(6):e0179044.2BROCKWELL-STAATS C,WEBSTER R G,WEBBY R J.Diversityof influenza viruses in swine and the emergence ofa novel human pandemic influenza A(HIN1)J.In-fluenza and Other Respiratory Viruses,2009,3(5):207-213.3IMAI M,KAWAOKA Y.The role of receptor binding spe-cificity in interspecies transmission of influenzavirusesJ.Current Opinion in Virology,2012,2(2):160-167.4VINCENT A L,PEREZ D R,RAJAO D,et al.Influenza Avirus vaccines for swineJl.Veterinary Microbio-1ogy,2017,206(1):35-44.5PEIRIS J S,POON L L,GUAN Y.Emergence of a novelswine-origin influenza A virus(S-0IV)HINl virusin humansJ.Journal of Clinical Virology:the Offi-cial Publication of the Pan American Society forClinical Virology,2009,45(3):169-173.6DZIABOWSKA K,CZACZYK E,NIDZWORSKI D.Detectionmethods of human and animal influenza virus-cur-rent trendsJ.Biosensors,2018,8(4):94.7MENG F,CHEN Y,SONG Z,et al.Continued evolution ofthe Eurasian avian-like HiNl swine influenza virusesin ChinaJ.Science China,2023,66(2):269-282.8LEWIS N S,RUSSELL C A,LANGAT P,et al.The globalantigenic diversity of swine influenza A virusesJ.Elife,2016,5:e12217.9CAI M,HUANG J,BU D,et al.Molecular evolution ofH1N1 swine influenza in Guangdong,China,20162017J.Infection,Genetics and Evolution:Journal ofMolecular Epidemiology and Evolutionary Geneticsin Infectious Diseases,2018,60:103-108.10YANG H,CHEN Y,QIAO C,et al.Prevalence,genetics,and transmissibility in ferrets of Eurasian avian-like HINl swine influenza viruses J.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2016,113(2):392-397.11SUN H,XIAO Y,LIU J,et al.Prevalent Eurasian avian-like H1Nl swine influenza virus with 2009 pandemicviral genes facilitating human infectionJ.Pro-ceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2020,117(29):17204-17210.（责任编辑