N-亚硝基布美他尼SD大鼠体内致突变性风险研究.pdf
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1、中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3307DOI:10.19803/j.1672-8629.20230684 中图分类号:R965文献标志码:A 文章编号:1672-8629(2024)03-0307-06N-亚硝基布美他尼 SD 大鼠体内致突变性风险研究文海若1,黄勤2,韩素芹1,姜华1,秦超1,石皓琨2,赵婷婷1,耿兴超1,汪祺3*(1中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心,药物非临床安全评价研究北京市重点实验室,北京 100176;2桂林南药股份有限公司,广西 桂林 541004;3中国食品药品检定研究院中药民族
2、药检定所,北京 100050)摘要:目的评价布美他尼杂质 N-亚硝基布美他尼的体内致突变风险和肝细胞 DNA 损伤风险。方法 SD 大鼠随机分为6组,分别为:溶媒对照组(溶媒为0.5%羧甲基纤维素钠),N-亚硝胺布美他尼100、300、1 000 mg kg-1剂量组,阳性对照组 1N-乙基-N-亚硝基脲(ENU),40 mgkg-1、阳性对照组 2 甲磺酸乙酯(EMS),200 mgkg-1。2 个阳性对照组均为每组 6 只动物,其余每组 12 只动物。大鼠连续 14 d 经口灌胃给予受试物 N-亚硝胺布美他尼。首次给药后约 14 d 和约 28 d 后采集外周血用于 Pig-a 基因突变率
3、检测,末次给药后约 3 h 取肝细胞开展彗星试验。结果试验期间给予 N-亚硝基布美他尼未导致异常临床症状和动物体重及摄食量改变。100、300、1 000 mgkg-1剂量组动物肝细胞平均 tail%DNA 值(平均数/中位数)分别为 2.900.38/2.340.46、3.580.27/2.870.51、3.450.59/2.211.44,与溶媒对照组相应数值相比未见差异,且无明显剂量效应相关性。首次给药后14 d,100、300、1 000 mgkg-1剂量组动物平均 RBCCD59-和 RETCD59-百万分之发生率(RBCCD59-百万分之发生率/RETCD59-百万分之发生率)分别为
4、 2.91.6/1.20.8、2.82.4/1.31.5、2.41.0/1.31.5;首次给药后 28 d,100、300、1 000 mgkg-1剂量组动物 RBCCD59-百万分之发生率/RETCD59-百万分之发生率分别为5.11.5/2.20.6、4.31.5/3.53.6、4.82.4/2.52.7。上述数值与相同时间点溶媒对照组相比均未见差异,且经统计学分析未见剂量效应相关性。结论连续经口给予 N-亚硝基布美他尼 14 d,SD 大鼠的最大耐受量高于 1 000 mgkg-1,未检出外周血基因突变风险和肝细胞 DNA 损伤风险。研究数据可为药品中遗传毒性杂质的合理监管和含 N-亚硝
5、基杂质药物的安全使用提供数据支持。关键词:N-亚硝基布美他尼;致突变性;遗传毒性;SD 大鼠;Pig-a 基因突变试验;彗星试验;灌胃Mutagenicity risk of N-nitrosobumetanil in SD ratsWEN Hairuo1,HUANG Qin2,HAN Suqin1,JIANG Hua1,QIN Chao1,SHI Haokun2,ZHAO Tingting1,GENG Xingchao1,WANG Qi3*(1Beijing Key Laboratory,National Center for Safety Evaluation of Drugs,Natio
6、nal Institutes for Food and Drug Control,Key Laboratory of Beijing for Nonclinical Safety Evaluation Research of Drugs,Beijing 100176,China;2Guilin Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guilin Guangxi 541004,China;3Institute of Chinese Traditional Medicine and Ethnic Medicine,National Institutes for Food and Drug
7、 Control,Beijing 100050,China)Abstract:Objective To evaluate the mutagenicity risk and hepatocyte DNA damage risk of bumetanide impurity-N-nitrosobumetanil in vivo.Methods SD rats were randomly divided into six groups:control group(0.5%CMC-Na),100 mgkg-1 dose group,300 mgkg-1 dose group,1 000 mgkg-1
8、 dose group,positive control group 1(N-ethyln-nitrosourea,ENU,40 mgkg-1)and positive control group 2(ethyl mesylate,EMS,200 mgkg-1).Both positive control groups consisted of six animals and the other groups had twelve animals in each.Rats were administered with N-nitrosobumetanil by oral intragastri
9、c administration for fourteen days.Peripheral blood was collected at about 14 days and 28 days after the initial administration for the detection of Pig-a gene mutation rates.Liver cells were collected about 3 hours after the last administration for comet test.Results During the study,N-nitrosobumet
10、anil did not result in abnormal clinical symptoms and there was no change in animal body mass or food intake.The averaged tail%DNA values(mean/median)of animal hepatocytes in 100 mgkg-1,300 mgkg-1 and 1 000 mgkg-1 dosage groups were 2.900.38/2.340.46,3.580.27/2.870.51 and 3.450.59/2.211.44,respectiv
11、ely,which showed no difference compared with the solvent control group,and no significant dose-effect correlation was observed.Fourteen days after the initial administration,the mean incidence of RBCCD59-and RETCD59-per million cells(RBCCD59-/RETCD59-)in 100 mgkg-1 dose group,300 mgkg-1 dose group a
12、nd 1 000 mgkg-1 dose group were 2.91.6/1.20.8,2.82.4/1.31.5 and 基金项目:国家自然科学基金资助项目(82374033)。作者简介:文海若,女,博士,研究员,遗传毒理学。为并列第一作者。*通信作者:汪祺,女,博士,研究员,药理毒理学。E-mail:基础与临床研究中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3308硝基化/亚硝基化反应广泛存在,N-亚硝基化合物是常见的化学合成/降解副产物1-2,在药品中作为杂质广泛存在。大量 N-亚硝基杂质可由药物降解产生,在化学结构上与药物有
13、效成分接近,属于药物相关的 N-亚硝基杂质(nitrosamine drug substance-related impurities,NDSRIs)。在当前美国药典中给出的药物中,30.2%为潜在 N-亚硝基杂质前体3。该类杂质不仅难以去除,且随储存时间延长在药品中含量持续增加。已有研究证实小分子 N-亚硝基化合物(如 N-亚硝基二甲胺和 N-亚硝基二乙胺)具有致癌性4-6,被人用药品技术要求国际协调理事会(ICH)指导原则 M7(R2):评估和控制药物中的 DNA 活性(致突变)杂质以限制潜在的致癌风险7列为“关注队列”。ICH M7 认为该类杂质的致癌性较强,人每日可接受限量应低于普通致
14、突变性杂质(即每日1.5 g)。如已有致癌性数据的 N-亚硝基二甲胺和 N-亚硝基二乙胺,其可接受摄入量应分别控制在每日96 ng 和每日26.5 ng,而对于毒理学数据不足的 N-亚硝基杂质的终身使用的可接受限度则为每日18 ng8。然而,大量 NDSRIs 的致突变性风险尚未经过充分评估。因致癌性与致突变性存在直接关联9,主要通过致突变性试验评估化合物的人体致癌性风险。布美他尼为一类间氨基苯磺酰胺的衍生物,口服 12 h 后血浆中含量达峰值,主要通过肝脏代谢,并通过抑制髓袢对氯离子的主动重吸收和钠离子的被动重吸收发挥利尿效应10,为临床常见的强效利尿药。N-亚硝胺布美他尼为布美他尼的杂质,
15、属于NDSRIs。目前缺少其体内毒性数据及致突变性相关研究数据。本研究参考经济合作与发展组织(OECD)相关技术指导原则11-12开展大鼠 Pig-a 基因突变试验和彗星试验,评价 N-亚硝基布美他尼体内致突变性风险,为其人体致突变性风险提供数据支持。毒理学给药途径应尽量与人暴露途径一致,故本试验选择经口灌胃给药。给药频度设置为连续给予14 d。根据试验原理及大鼠生物标志物峰值出现时间,于末次给药后约 3 h 取肝细胞用于彗星试验分析,分别于给药14 d 和 28 d 采集外周血用于Pig-a 基因突变检测,从而对 N-亚硝基布美他尼的人体暴露安全性进行评估。1 材料与方法1.1 实验动物60
16、 只 SPF 级 SD 大鼠(67 周龄),雌雄各半,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物许可证号:SCXK(京)2021-0011。大鼠在屏障系统内 PC 聚碳酸酯鼠盒饲养(北京科澳协力饲料有限公司),提供钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料,自由摄取。饲养环境保持温度 2026,湿度40%70%,换气频率为每小时15 次以上,照明时间每日12 h。本试验方案实施前已经国家药物安全评价监测中心实验动物福利伦理委员会伦理审查批准(伦理批复编号:IACUC-2023-035)。动物的使用符合 3R(Reduction,Replacement,Refinement)原则。本研究严格按照国家食品药
17、品监督管理局令第 34 号药物非临床研究质量管理规范(2017.9.1)13要求实施。1.2 仪器和试剂流式细胞仪(美国BD bioscience,型号:FACS AriaTM III);免疫磁性分离架(德国 Miltenyi,型号:Quadro MACSTM Separator);荧光显微镜(日本 Nikon,型号:Eclipse 80i);正置自动显微镜(日本 Olympus,型号:BX63);自动细胞计数仪(美国 Life Technologies,型号:Countness II FL);彗星图像分析系统(英国Instem,型号:Comet Assay IV)。N-亚硝胺布美他尼(桂林南
18、药股份有限公司,批号:BC-NO230306S,纯度:95.9%);羧甲基纤维素钠(Sigma-Aldrich,批号:SLBQ8545V);N-乙基-N-亚硝基脲(Sigma-Aldrich,批号:MKCM3342);甲磺酸乙酯(Sigma-Aldrich,批号:BCCF0900)。LS Columns(MiltenyiBiotec,批号:5210831084);Anti-PE MicroBeads(MiltenyiBiotec,批号:5230402830);PE-anti CD59(BD Pharmingen,批号:1208460);PE-anti CD612.41.0/1.31,respe
19、ctively.Twenty-eight days after the initial administration,the mean incidence of RBCCD59-and RETCD59-per million cell(RBCCD59-/RETCD59-)in the 100 mgkg-1 dose group,300 mgkg-1 dose group and 1 000 mgkg-1 dose group was 5.11.5/2.20.6,4.31.5/3.53.6,and 4.82.4/2.52.7,respectively.The above values were
20、not different from those of the solvent control group at the same time point,and no correlation of dose effect was observed by statistical analysis.Conclusion After fourteen days of oral administration of N-nitrosobumetanilis,the maximum tolerance of SD rats exceeds 1 000 mgkg-1,and the risk of peri
21、pheral blood gene mutation and hepatocyte DNA damage is not detected.The data can be used to back up the regulation of genotoxic impurities in drugs and the safe use of drugs containing N-nitroso impurities.Keywords:N-nitrosobumetanil;mutagenicity;genotoxicity;SD rat;Pig-a gene mutation assay;comet
22、assay;intragastric administration中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3309(BD Pharmingen,批号:B335406);Lympholyte-Mammal(CEDARLANE,批号:55-212);SYBR Gold fluorescent nucleic acid stain(ThermoFisher,批号:2383798);CountBright Absolute counting beads(ThermoFisher,批号:2361082);PBS(Hyclone,批号:AH30
23、688722)Comet Assay LMAgarose(RD systems,批号:P358990);EDTA-2Na(Sigma-Aldrich,批号:20210301);D-Hanks(solarbio,2305002);SYBR Gold核酸凝胶染液(ThermoFisher,批号:2291643)。1.3 动物分组及给药检疫结束后根据动物分组日体重按分层随机化法分组,共 60只大鼠分为 0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶媒对照组,N-亚硝胺布美他尼 100、300、1 000 mg kg-1剂量组,阳性对照组1N-乙基-N-亚硝基脲(ENU),40 mgkg-1,阳性对照组 2
24、 甲磺酸乙酯(EMS),200 mgkg-1。2 个阳性对照组每组均为 6只动物,其余每组 12只动物。每组动物个体体重差异小于平均体重的20%。给药方式为经口灌胃。0.5%CMC-Na 和 N-亚硝基布美他尼连续 14 d 经口灌胃给予;阳性对照均为连续 3 d 给予,ENU 分别在第1、2、3 天给予,EMS分别在第12、13、14天给予。2个阳性对照组给药体积为 20 mL kg-1,其余各组给药体积均为10 mL kg-1。末次给药结束后,除阳性对照组1外其余 5 组各取 6只大鼠取材用于彗星试验。末次给药时间距离给药结束解剖时间约 3 h。剩余 0.5%CMC-Na 溶媒对照组、10
25、0、300、1 000 mgkg-1剂量组及阳性对照组 1 动物用于Pig-a 基因检测采血。1.4 观察、称重和麻醉给药期间每天上下午隔笼观察所有动物是否存在死亡、濒死、活动状况、外观及被毛、有无外伤、粪便等情况;每周测定体重 1次。动物末次采血后所有动物经二氧化碳吸入法实施安乐死。1.5 外周血 Pig-a 基因突变试验分别于首次给药后14 d 和 28 d 经眼眶采集约每只200 L 外周血。采血时使用异氟烷吸入法麻醉,采血后棉球按压止血。血样经 K2EDTA 抗凝后暂时于 28条件下保存备用。取抗凝血约 80 L。参考课题组前期研究,使用流式细胞仪检测大鼠红细胞表面 CD59 蛋白的结
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