黄热病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定.pdf
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1、D208-09ChineseVeterinaryScience网络首发时间:2 0 2 3-11-152024,54(02):208-216中国兽医科学0l:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0045中图分类号:S852.659.2文献标志码:A文章编号:16 7 3-46 96(2 0 2 4)0 2-0黄热病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定刘纪茹1,2,胡潇予1,李春缘,刘灵?,徐晓立2,陈月?,任瑞文2,袁子国1*(1.华南农业大学兽医学院,广东广州510642;2.南部战区疾病预防控制中心,广东广州510507)摘要:制备黄热病毒单克隆抗体并分析其生物
2、学特性,进而筛选出具有杀伤力的中和抗体,为黄热病毒临床检测方法及特效药的研发提供实验室基础。使用乳鼠脑进行黄热病毒的传代扩增,通过常规方法对6 8周龄的BALB/c小鼠进行动物免疫,经细胞融合、免疫荧光检测及有限稀释克隆后,筛选制备黄热病毒单克隆抗体共14株。经ELISA鉴定单抗亚型,发现有2 株单抗为IgG2b亚型,1株为IgM亚型,1株为IgG2a亚型,其余均为IgG1亚型;经免疫荧光法鉴定单抗特异性,发现有12 株单抗与所检测的病毒株均无交又反应;经qRT-PCR方法及免疫荧光法评估单抗细胞上清液及其腹水对黄热病毒的中和作用,发现有3株单抗的中和效果较佳。本研究获得了12 株特异性较高的
3、单克隆抗体,其中有3株单抗对黄热病毒具有良好的中和作用。关键词:黄热病毒;单克隆抗体;中和作用Preparation of monoclonal antibodies against yellow fever virus andidentification of their biological characteristicsLIU Jiru-2,HU Xiaoyu,LI Chunyuan,LIU Jiong,XU Xiaoli?,CHEN Yue?,REN Ruiwen?,YUAN Ziguo(1.College of Veterinary Medicine,South China Agri
4、cultural University,Guangzhou 510642,China;2.Southern Theater Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 510507,China)Abstract:The aim was to prepare monoclonal antibodies(McAbs)against yellow fever virus(YFV)andanalyze their biological characteristics,and then screen out McAbs with lethali
5、ty,which providedlaboratory basis for development of clinical detection methods and specific drugs of YFv.Using thebrain of lactating mice subpassaged YFV,BALB/c mice of 68 weeks old were immunized by conventionalmethods,and 14 McAbs against YFV were screened and prepared by cell fusion,immunofluore
6、scence detectionand limited dilution clones.The subtypes of McAbs were identified by ELISA,and the results showed that2 McAbs were IgG2b subtype,1 was IgM subtype,1 was IgG2a subtype,and the rest were IgGl subtype.Thespecificity of McAbs was identified by immunofluorescence method,found that 12 McAb
7、s did not cross-reactwith the detected virus strains.qRT-PCR method and immunofluorescence method were used to evaluate theneutralization effect of McAb cell supernatant and ascites on YFV,the results showed that 3 strains ofMcAb had better neutralization effect.In this study,12 McAbs of YFV with hi
8、gh specificity were obtained,among which 3 had good neutralization effect on YFv.Key words:yellow fever virus;monoclonal antibodies;neutralization*Corresponding author:YUAN Ziguo,E-mail:黄热病毒(Yellowfevervirus,YFV)是黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒,直径大小为2 2 38nm,基因组全长约11kb,其基因亚型包括东非型、西非型、南美洲I型和南美洲II型 。黄热病是一种收稿日期:2 0
9、 2 3-0 5-13;修回日期:2 0 2 3-0 9-2 5基金项目:广东省自然科学基金面上项目(2 0 2 2 A1515011132);全军实验动物专项(SYDW2018J04)作者简介:刘纪茹(1996-),女,山西临汾人,硕士生,主要从事人兽共患病研究,E-mai1:L1912 0 3952 53 16 3.c o m。*通讯作者:袁子国(197 8-),男,黑龙江人,教授,博导,主要从事人兽共患病研究,E-mail:z i g u o y u a n s c a u.e d u.c n。209刘纪茹等:黄热病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定第2 期经蚊虫和血蜱传播给人类及非
10、人灵长类动物的急性虫媒传染病,其临床表现主要为发热、黄疽、出血,严重时可造成死亡,主要流行于非洲和南美洲等热带地区2 。黄热病经奴隶贸易引入美洲,并以伊蚊为传播媒介在城市中流行暴发3。192 8 年,通过杀虫剂有效控制了流行于巴西里约热内卢记录中的最后一场城市黄热病,并于2 0 世纪50 年代,通过一场密集的根除运动消灭了生存在巴西的埃及伊蚊及其他可传播黄热病毒的伊蚊4-5。但在2 0 世纪7 0 年代,埃及伊蚊的重现再次给巴西地区带来了黄热病毒;2016年底,黄热病暴发流行于巴西米纳斯吉拉斯州,且具有森林循环城市化的可能性6 。虽然此次的发病人数因使用黄热病毒疫苗而有所降低,但是其主要传播媒
11、介(埃及伊蚊和白纹伊蚊)在美洲大陆的分布越来越广泛7 。这也预示着黄热病毒很有可能随着伊蚊分布区域的扩大、全球气候的变暖及旅游业的全球性发展而出现新的流行区域,而此预测已在欧洲、北美洲及亚洲部分城市的相关报道中得到证实8 。虽然我国暂时仍未出现黄热病患者,但是并不排除有输人性病例的风险,应得以重视。目前,聚合酶链反应快速检测法是黄热病毒的主要检测方法,该方法的特异性及灵敏度较高。但缺乏快速筛查黄热病毒的方法及可用于治疗黄热病的特效药。本研究旨在制备和筛选黄热病毒中和抗体,为今后探究中和抗体的保护机制以及特效药的研发奠定基础,对该类疾病的临床诊断、流行病学调查与疫情防控具有重要意义。1材料与方法
12、1.1毒株及实验动物黄热病毒17 D株、寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)、西尼罗河病毒(WestNilevirus,WNV)、登革1型病毒(Denguevirustype-1,DENV-1)Hawai株、登革2型病毒(Denguevirus type-2,DENV-2)NGC株、登革3型病毒(Denguevirus type-3,DENV-3)H87株、登革4型病毒(Denguevirustype-4,DENV-4)H241株、森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JE
13、V)中山株、兰格特病毒(Langatvirus,LGTV)TP21株、墨累谷脑炎病毒(MurrayValleyencephalitisvirus,MVEV)、跳跃病毒(Louping illvirus,LIV)、卡萨诺尔森林病病毒(KyasanurForest Disease virus,KFDV),均由南部战区疾病预防控制中心传代保存。3日龄昆明小鼠乳鼠及8 周龄雄性BALB/c小鼠,均购自南方医科大学实验动物中心。1.2试剂及仪器DMEM培养基、0.2 5%Trypsin-EDTA(1X)均购自Gibco公司,胎牛血清购自南京生航生物技术有限公司,抗体分型试剂盒(MouseMonoclon
14、alAn-tibodyIsotypingReagents)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT Media Supplement(50 X)、H T M e d i aSupplement(50 X)均购自Sigma公司,核酸提取或纯化试剂盒(NucleicAcidExtractionKit)购自广州达安基因股份有限公司。低温快速组织研磨匀浆仪,双通道数控型注射乳化器,多功能酶标仪(Spark10M),倒置荧光显微镜(HBO50),细胞成像多功能微孔板检测系统(BioTekCytation1),电转电融合器(ECFG21),伯乐10 0 0 PCR仪(CFX96Real-TimeSystem
15、)等。1.3病毒扩增及动物免疫制备17 D株病毒悬液,将其注入3日龄乳鼠脑中进行扩增,2 0 0 L/只。每日观察乳鼠生存情况,待乳鼠有拒乳、侧卧、离群等异常现象时,无菌操作取出乳鼠脑,置于1mL的1PBS中,研磨离心后取上清液,加人等体积弗氏完全佐剂进行乳化,并对BALB/c小鼠采用多点皮下注射的方式进行动物免疫,400L/只。间隔2 周后进行第2 次免疫,将弗氏不完全佐剂与病毒悬液等比例混合并乳化,40 0 L/只。第3次免疫方法与第2 次相同。细胞融合前3d进行加强免疫以提高免疫抗体效价1.4用间接免疫荧光试验(IFA)评估免疫抗体效价收集免疫小鼠血清,评估其效价。首先选择生长状态良好的
16、Vero细胞,通过病毒侵染、固定、通透、洗涤及封闭制备YFV抗原板,使用样品稀释液将小鼠血清按照1:50 0、110 0 0、1:2 0 0 0、1:40 0 0、1:8000、1:16 0 0 0、1:32 0 0 0 和1:6 40 0 0 进行倍比稀释,并加人上述抗原板中依次进行孵育、PBST洗涤、二抗孵育、PBST洗涤及烘干,置于荧光显微镜下观察荧光信号的强弱并判定其抗体效价1.5细胞融合、筛选及克隆按照ECFG21电融合法进行细胞融合。配制融合缓冲液,过滤并高压灭菌后备用。选取免疫抗体效价最高的BALB/c小鼠,麻醉处死,使用无菌手术剪剪开皮肤后,摘取小鼠脾并研磨,对研磨后的脾细胞进
17、行计数;使用胰酶消化SP2/0细胞后,将其置于适量DMEM培养基中并计数。按照1:4比例混合上述2 种细胞后,加人融合缓冲液,离心弃上清;加人1mL融合缓冲液重悬细胞,将细胞吹打均匀后移入电泳槽中进行融合。融合时,将电阻值控制在50 0 150 0 Q之间。待融合结束后,将细210第54卷中国兽医科学胞悬液轻轻移入37 预热好的2 mLDMEM培养基中,静置10 min,离心弃上清。用HAT选择培养基重悬细胞并将其铺96 孔细胞培养板中。待细胞密度达到50%以上,取细胞上清液,使用IFA法筛选阳性细胞孔;吸取阳性细胞孔内部分细胞,进行10倍梯度稀释,共设12 个稀释度。对筛选克隆后的阳性细胞株
18、进行扩增培养并保种1.6单克隆抗体的扩增及其效价的评估使用DMEM培养基重悬单抗细胞株,并进行腹腔注射,每只BALB/c小鼠注射剂量为0.5mL,注射细胞量约为110 7 个。当小鼠出现腹腔极具胀大、呼吸急促、行动迟缓、精神不佳等症状时开始收集腹水,离心后取上清,一8 0 保存备用。使用IFA法,将腹水按照1:10 0 0、1:2 0 0 0、1:40 0 0、1:8 0 0 0、1:16 0 0 0、1:32 0 0 0、1:6 40 0 0、1:12 8 0 0 0 进行倍比稀释后作用于YFV抗原板,设立空白小鼠的腹水为阴性对照。在荧光显微镜下观察荧光强度并判定其结果,将荧光强度为“十十十
19、”的最小稀释倍数所对应的稀释梯度判定为该腹水的效价1.7单克隆抗体生物学特性的鉴定1.7.1亚型鉴定使用ELISA方法对单抗亚型进行鉴定。首先,对6 种分型抗体(IgG1、Ig G 2 a、Ig G 2 b、IgG3、I g M 和IgA)进行包被;将阳性细胞株上清液按照1:4稀释后作用于分型抗体,37 孵育;使用HRP-山羊抗小鼠IgG抗体进行二抗孵育;TMB显色并检测其吸光度值。1.7.2特异性鉴定使用IFA方法对单抗特异性进行鉴定。将阳性细胞株上清液分别作用于YFV、ZIKV、W NV、D ENV-1、D ENV-2、D ENV-3、D ENV-4、TBEV、JEV、LG T V、M V
20、EV、LIV、K FD V的抗原板上,进行交叉试验,设定SP2/0细胞上清液为阴性对照。在荧光显微镜下观察其荧光信号强度,结果判定:“十十十十”为极强;“十十十”为较强;“十十”为较弱;“十”为极弱1.7.3中和试验使用IFA方法和qRT-PCR方法分别对单抗的中和作用进行定性及定量评估。首先,将生长状态良好的Vero细胞分别置于2 4孔细胞板和96 孔细胞板中,细胞量分别为110 5个/孔和3X104个/孔,CO,培养箱中培养过夜。将单克隆细胞株上清液按照1:4稀释,并与1:10 0 0 稀释的17D株病毒悬液混合孵育;将其转移至已准备好的24孔细胞板和9 6 孔细胞板中,孵育2 h;弃掉上
21、清液,更换2 0 mL/LFBS的DMEM培养基继续培养60h。96 孔细胞板通过IFA方法检测单抗的中和作用;2 4孔细胞板通过qRT-PCR方法检测单抗的中和作用。使用IFA方法对单抗腹水的中和作用进行评估。取适量Vero细胞置于96 孔细胞板中,每孔细胞量为310 4个,CO培养箱中培养过夜;次日,将YFV病毒悬液按照1:10 0 0 稀释后转移至细胞中,置于COz培养箱中孵育2 h,并弃掉液体;更换20mL/LFBS的DMEM培养基继续培养6 0 h;将具有中和作用的腹水及YFV多克隆抗体按照1:10 0、1:200、1:40 0、1:8 0 0、1:16 0 0、1:32 0 0、1
22、:6 40 0和1:12 8 0 0 进行稀释,并作用于上述96 孔细胞板中,同时将空白小鼠血清设定为阴性对照;37 恒温箱中烘干1h,于荧光显微镜下观察荧光强度。2维结果2.1单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选经5次克隆,成功筛选出了14株可分泌黄热病毒单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,依次命名为YFVMcAb-1YFVMcAb-2YFVMcAb-3YFVMcAb-4,YFVMcAb-5YFVMcAb-6.YFVMcAb-7YFVMcAb-8YFVMcAb-9YFVMcAb-10YFVMcAb-11YFVMcAb-12、Y FV M c A b-13、Y FV M c A b-14(见图1)。2.2单
23、克隆抗体的制备及其效价的评估通过制备小鼠腹水获得大量单克隆抗体后,经IFA方法评估单抗效价,结果表明,腹水效价最高可达到1:12 8 0 0 0(见表1)。2.3单克隆抗体的亚型鉴定经ELISA方法分析单抗亚型,结果显示,有2 株单抗为IgG2b亚型、1株为IgM亚型、1株为IgG2a亚型,其余均为IgG1亚型(见图2)。2.4单克隆抗体特异性的鉴定IFA检测结果显示,YFVMcAb-1与TBEV有交叉反应,YFVMcAb-4与DENV-2和 LIV有交叉反应,其余单克隆抗体与所检测的病毒株均无交叉反应(见表2)。2.5单克隆抗体中和试验选取单抗YFVMcAb-11,对单抗细胞株上清液的使用浓
24、度进行评估,结果(见图3)表明,当细胞上清液4倍稀释时,单抗对YFV仍具有较好的中和作用。将单克隆细胞株上清液按照1:4稀释后进行中和试验,qRT-PCR检测结果分析表明,14株单克隆细胞株中有3株单抗对YFV具有中和作用,分别是 YFVMcAb-11、Y FV M c A b-13 和 YFVMcAb-14。将以上3株单抗的细胞上清液进行4倍、8 倍、16 倍稀释,17 D株病毒悬液进行50 0 倍、10 0 0 倍、2 0 0 0211刘纪茹等:黄热病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定第2 期B100um100um100umDEF100um100.umH-100m100um100um图
25、1单克隆抗体IFA筛选结果Figure 1 Monoclonal antibody IFA screening resultsAG:阳性单克隆抗体;H:阴性对照(SP2/0细胞上清液);I:阳性对照(BALB/c小鼠血清)。A-G:Positive monoclonal antibody;H:Negative control(SP2/0 cell supernatant);I:Positive control(BALB/c mouse serum).表114株单抗腹水的制备及其效价评估Table 1 Preparation of 14 monoclonal antibody ascites a
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