H5N8亚型禽流感病毒HA1蛋白的抗原表位鉴定.pdf

07ChineseVeterinaryScience网络首发时间：2 0 2 3-10-2 72024,54(01):12-18中国兽医科学D0I:10.16656/jissn.1673-4696.2024.0016中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 9 6（2 0 2 4)0 1-0 0 12H5N8亚型禽流感病毒HA1蛋白的抗原表位鉴定汪亮，杜英英，徐帅*（中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室，甘肃兰州730046)摘要：为了确定H5N8亚型禽流感病毒的新抗原表位，将原核表达的H5N8亚型禽流感QH448毒株HA1蛋白为免疫原免疫小鼠，通过筛选获得5株抗QH448(H5N8）H A 1蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经鉴定，1H12B9、8 A 12 D 10 和9H10F5的重链为IgG1亚型，2 A9D11和7 E9G6的重链为IgG2b亚型，而轻链均为K链。5株单克隆抗体均能特异性识别H5亚型禽流感病毒HA蛋白。通过截短表达策略确定，1H12B9和7 E9G6的识别表位为330 ATGLRNSPLREKRRKR345,2A9D11、8 A 12 D 10 和9H10F5的识别表位分别为310 IHPLTIGECPKYVKSN325、2 7 K IVK K G D ST IM K SEV2 8 5和12 1LSRINHFEKILIIPKS136。同源性比较结果显示，筛选出的4个抗原表位在H5-HA蛋白序列中均高度保守。综上所述，本研究获得了5株抗H5-HA蛋白不同抗原表位的特异性单克隆抗体细胞株，为H5N8亚型禽流感的诊断提供了新的靶标抗体关键词：禽流感病毒；H5N8亚型；HA1蛋白；单克隆抗体；抗原表位Epitope identification of HA1 protein of avian influenza virusH5N8 subtypeWANG Liang,DU Yingying,XU Shuai(State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of A gricultural Sciences,Lanzhou 730046,China)Abstract:In order to confirm the new epitopes of avian influenza virus H5N8 subtype,the prokaryoticHAl protein of H5N8 influenza virue QH448 strain was used as immunogen to immunize mice.A total of fivestable hybridoma cell lines were eventually obtained by secreting monoclonal antibodies against QH448HA1 protein.The 1H12B9,8A12D10,and 9H10F5 antibodies were IgG1 type,and the 2A9D11 and 7E9G6 antibodieswere IgG2b type,while the light chains of all antibodies were k chain.The 5 monoclonal antibodies couldspecifically recognize the HA protein of avian influenza virus H5 subtype.By using HAl proteintruncations,it was confirmed that the 1H12B9 and 7E9G6 recognized the epitope 330ATGLRNSPLREKRRKR345 of HAprotein of H5N8 avian influenza virus,the 2A9D11 recognized epitope 310IHPLTIGECPKYVKSN325,the 8A12D10recognizedepitope 2IKIVKKGDSTIMKSEV25,and the 9H1OF5 recognized epitope 2LSRINHFEKILIIPKSI13.Homologycomparison showed that the four screened antigenic epitopes were highly conserved in the H5-HA proteins.These results indicated that five monoclonal antibodies were developed and characterized,which canrecognize four different epitopes of H5-HA protein.The findings provided new antibodies for thediagnosis ofH5N8avianinfluenza.Key words:avian influenza virus;H5N8 subtype;HAl protein;monoclonal antibodies;epitope*Corresponding author:XU Shuai,E-mail:收稿日期：2 0 2 3-0 8-2 1；修回日期：2 0 2 3-10-2 5基金项目：国家自然科学基金项目（32 17 2 8 2 0）作者简介：汪亮（1992-），男，甘需武山人，硕士生，研究方向为禽流感病毒流行病学及其致病性研究，E-mail：。*通讯作者：徐帅，副研究员，博士，E-mail:。13汪亮等：H5N8亚型禽流感病毒HA1蛋白的抗原表位鉴定第1期禽流感是由禽流感病毒（Avian influenzavirus，AIV)引起的一种高度传染性疫病,在全球范围内广泛传播。禽类感染不同致病性的AIV后，表现出的临床症状差异较大，有的临床症状表现轻微，有的表现出呼吸道疾病和产蛋下降，严重的会导致出现全身性症状，而高致病性禽流感的易感动物群死亡率可达10 0%。高致病性H5亚型AIV，如H5N1亚型、H5N6亚型和H5N8亚型，不仅感染禽类，还能跨越动物种间障碍通过家禽传播给人类-2 1。2 0 10年，在我国江苏省首次检测出H5N8亚型AIV，命名为AIVA/duck/Jiangsu/k1203/20103。2 0 14年在亚洲和欧洲的9个国家的野鸟和家禽体中监测到了高致病性H5N8AIV其HA基因属于Clade2.3.4.4分支 4,2 0 14年底，在北美的野鸟和家禽中相继检测到该病毒 5。2 0 16 年，分离于青海湖斑头雁的H5N8亚型禽流感病毒中出现了1个新的谱系，属于Clade2.3.4.4groupB，随后传播到了东亚、西伯利亚和欧洲 6。H5N8亚型AIV的暴发通常发生在冬春季节（每年11月至次年2 月），这与野生鸟类的迁时间一致，说明H5N8亚型AIV在世界范围内的传播与鸟类的迁徙密切相关 7。2 0 2 0 年12 月，俄罗斯首次报道人感染H5N8亚型AIV是从养殖场工人的鼻咽拭子中检测到的，并从1份人临床标本中分离获得1株H5N8亚型禽流感病毒 8 AIVHA蛋白是病毒粒子表面的最主要成分，除了在受体结合、融合、包装及致病性方面发挥重要作用外，还是宿主获得性免疫系统识别的主要对象 9。AIV感染宿主以后，HA蛋白能够诱导宿主强烈的免疫反应，诱导产生中和抗体。HA蛋白是诱导保护性抗体免疫反应的主要抗原，也是AIV疫苗研制的主要靶抗原10。HA蛋白被宿主蛋白酶水解成HA1蛋白和HA2蛋白 1。HA1蛋白负责与宿主细胞表面受体末端唾液酸残基结合，这是复制的第一阶段。除此以外,HA1蛋白是HA蛋白重要的病毒受体结合位点和抗原决定簇区域，几乎包含了HA蛋白所有的抗原表位 12。单克隆抗体是研究HA1蛋白结构和功能的有效工具。因此，本研究通过制备H5N8亚型AIVHA1蛋白的单克隆抗体，鉴定新的抗原表位，为开发新的H5亚型AIV检测方法提供理论基础和实验依据1材料与方法1.1细胞与试剂293T细胞和A549细胞（人肺癌上皮细胞）均由本实验室保存。PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase、限制性内切酶SalI和NotI均购于美国NEB公司。BL21(DE3)和DH5感受态细胞均购自宝生物工程（大连）有限公司。Rosetta感受态细胞购于全式金生物技术有限公司。胶回收试剂盒(D2500-02)与质粒小提试剂盒（D6945-02*）均购自OMEGA公司。Western-blot所用抗体购自Abcam公司。ProteinA磁珠（L00273)购自金斯瑞生物科技股份有限公司。Lipofectamine2000转染试剂购自Invitrogen公司。小鼠抗体亚类鉴定试剂盒购自SBA公司。DAPI购自北京索莱宝科技有限公司。1.2质粒A/Bar headed goose/Qinghai/448/2017(H5N8)HA基因真核表达质粒pRK-QH448-HA、A/g o o s e/Sichuan/SC15/2015（H 5N6）H A 基因真核表达质粒pRK-SC15-HAA/Environment/Suzhou/SZ19/2014(H7N9)HA基因真核表达质粒pRK-SZ19-HA和A/goose/Guangdong/306/2017（H 7 N9）H A 基因真核表达质粒pRK-GD306-HA均由中国农业科学院兰州兽医研究所动物病毒分子生态学创新团队提供和保存1.3免疫蛋白的表达和纯化根据H5N8亚型AIVQH448毒株的HA1蛋白基因序列，设计如下引物，,pET-28a-QH448-HA1-F:5-CCGGAATTCCCGGGTCGACTCATGGAGA-ACATAGTGCTT-3,pET-28a-QH448-HA1-R:5-TCGTCAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTCTTTT-TCTTCTCTTTTC-3，下划线部分分别为引人的SalI和NotI酶切位点，以实验室保存的真核表达质粒pRK-QH448-HA为模板,扩增目的基因。将目的基因和酶切后的pET-28a载体进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将符合目的条带大小的片段切胶回收，连接转化到DH5感受态细胞中。筛选双酶切鉴定和测序正确的阳性质粒转化至BL21（D E3)感受态细胞中进行蛋白表达，表达后收集菌体进行破碎，收集上清，使用镍柱亲和层析法纯化表达的蛋白。对纯化蛋白进行透析浓缩后，用蛋白电泳及免疫印迹检测纯化蛋白的特异性与浓度 131.4单克隆抗体的纯化选取4只6 8 周龄雌性BALB/c小鼠，将纯化后的QH448HA1蛋白与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后，每只小鼠皮下多点注射50 g抗原。第14和2 8 天分别以相同剂量对小鼠进行加强免疫。每次免疫前1天，采集小鼠血清，检测免疫小鼠的抗体效价。在细胞融合前3天，小鼠皮下多点注射抗原进行加强免疫。取免疫小鼠的脾，分离脾细胞，与14第54卷中国兽医科学SP2/0细胞进行融合，之后铺于96 孔板中，在37、50mL/LCOz的培养箱中培养。用间接ELISA方法检测细胞上清，对阳性孔经过34次亚克隆后14,获得稳定分泌抗QH448HA1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1H12B9、2 A 9D 11、7E9G6、8 A 12 D 10 和9H10F5。将杂交瘤细胞株进行扩大培养，收集培养上清后采用ProteinA琼脂糖亲和纯化层析进行纯化。纯化后的单克隆抗体通过SDS-PAGE分析。用SBA Clonotyping System-HRP试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行亚类鉴定1.5单克隆抗体的Western-blot验证提前将2 93T细胞铺于6 孔板中（每孔2 10 5个），待细胞密度长至7 0%8 0%时，更换细胞培养液为不含血清成分的培养基；在盛有2 50 LOpti-MEM的管中加入1g各HA蛋白真核表达质粒；在另一管中加人2 L的Lipofectamine2000与2 50 LOpti-MEM混合均匀；孵育10 min，将2 管混合轻轻吹打均匀，静置15min后加入到细胞中；在37、50mL/LCO培养箱中培养6 h后换液。继续培养24h后弃去培养液,用PBS洗1遍，收集细胞。加人200L含蛋白酶抑制剂的裂解液，之后加入等体积的SDS上样缓冲液与之混合均匀，用10 0 金属浴处理样品10 min，处理好的样品离心10 min后进行SDS-PAGE。转膜结束后,用10 mL50g/L的脱脂奶粉溶液封闭2 h。室温孵育一抗（纯化的单克隆抗体稀释比例1：10 0 0)2 h。洗膜3次。室温孵育HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗（稀释比例1：50 0 0)40min,洗膜35次。用吸水纸压平硝酸纤维素膜,经ECL显色1.6单克隆抗体的间接免疫荧光试验将高压消毒后的细胞爬片放入12 孔板中（每孔110 5个细胞），加入0.1mg/mL的多聚赖氨酸预包被。将A549细胞铺于12 孔板中培养，待细胞贴壁且密度长至7 0%8 0%时，转染1gpRK-QH448-HA蛋白表达质粒与Lipofectamine2000转染试剂。转染6 h后换液，继续培养2 4h后,弃掉培养基,用PBS清洗细胞3次。用40 g/L多聚甲醛固定2 0 min;PBS清洗细胞3次；加人5mL/LTritonX-100通透2 0 min。使用PBS清洗细胞3次；用50mL/L脱脂奶粉溶液封闭30 min，封闭过后孵育一抗（纯化的单克隆抗体），4孵育过夜，使用PBS清洗细胞5次；加入1：50 0 0 稀释的Cy3标记的山羊抗小鼠IgG抗体，室温孵育6 0 min，使用PBS清洗细胞5次；使用DAPI染色8 min，之后用PBS清洗细胞5次，每次5min；封片；在荧光显微镜下观察并采集图像。1.7单克隆抗体抗原表位的鉴定分析QH448毒株的HA1基因序列，设计特异性引物扩增不同的截短体，构建HA1蛋白的一系列重叠肽，采用肽扫描技术进行单克隆抗体抗原表位鉴定：第1轮筛选将HA1蛋白（全长345aa）自C端至N端依次构建1345aa、130 0 a a、12 50 a a、12 0 0 a a、118 1 a a、1136 a a.112 1 a a、110 6aa51345 a a、10 1345 a a、151345 a a 和 2 0 1345aa的截短多肽（如多肽51345aa表示HA1蛋白的第51aa至345aa，全长2 95aa）；第2 轮筛选根据第1轮鉴定出的识别表位构建截短多肽以缩小范围。在HA1301345a a 之间，构建了30 1315aa、31032 5a a.32 0 335a a 和330 345aa的截短多肽;在HA125130 0 a a 之间，构建了2 512 6 5aa、2612 7 5a a、2 7 12 8 5a a 和2 8 130 0 aa的截短多肽。使用PrimerPremier5软件设计各个截短多肽基因的特异性引物，扩增目的基因,采用同源重组方法分别连接到pGEX-4T-1载体构建重组质粒。测序正确的质粒转化到Rosetta感受态细胞表达重组蛋白。挑取单菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养基中,37、2 2 0 r/min进行培养，当菌液D630值为0.6 左右时，加人终浓度为1mmol/LIPTG诱导，372 2 0 r/m in 继续培养12 h。8 0 0 0 r/m in 离心1min收集菌体，沉淀用初始菌液1/10 体积的PBS重悬。留取诱导前的样品作为对照。将诱导前后的样本进行SDS-PAGE分析，以确定有无蛋白表达。诱导表达正确的各个重组质粒蛋白进行Western-blot，其中以纯化的单克隆抗体为一抗（稀释比例1：10 0 0）,HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体为二抗(稀释比例1：6 0 0 0)1.8单克隆抗体识别表位的同源性比较筛选出的表位用Pymol软件确定其在流感病毒H5亚型HA蛋白上氨基酸序列的位置。在NCBI网站（https：/w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/）下载不同Clade分支的代表性H5亚型AIV毒株HA蛋白序列，寻找其表位所在区域进行分析，比较同一位置氨基酸出现的频率2结果2.1单克隆抗体的筛选及其亚类鉴定经单克隆抗体亚类鉴定试剂盒的鉴定，1H12B9、8A12D10和9 H10F5单克隆抗体的重链为IgG1，2A9D11和7 E9G6的重链为IgG2b。5株单克隆抗体的轻链均为K链（见表1）。15汪亮等：H5N8亚型禽流感病毒HA1蛋白的抗原表位鉴定第1期表1单克隆抗体的亚类鉴定Table 1Characteristics of the monoclonal antibodies单克隆抗体亚类轻链MonoclonalantibodiesIsotypeLight chain1H12B9IgG1K2A9D11IgG2bK7E9G6IgG2bK8A12D10IgG1K9H10F5IgG1K2.2单克隆抗体的纯化单克隆抗体纯化鉴定结果如图1所示：纯化后的单克隆抗体都具有分子质量约为55ku和2 5ku两条蛋白染色带，分别为IgG蛋白的重链和轻链这一结果表明单克隆抗体纯化效果较好2.3单克隆抗体的特异性鉴定Western-blot和间接免疫荧光试验结果如图2所示,5株单克隆抗体均能够特异性地与H5亚型HA蛋白反应,与H7亚型的HA蛋白不反应。可以M12345180ku130ku100ku70ku55ku重链Heavy chain40ku35ku轻链25kuLightchain图1单克隆抗体的SDS-PAGE分析Figure 1 SDA-PAGE analysis of the monoclonal antibodiesM：蛋白质分子质量标准；1 5：依次为纯化的1H12B9、2 A 9D 11、7E9G6、8 A 12 D 11和9H10F5单抗。M:Protein molecular weight Marker;1-5:Purified 1H12B9,2A9D11,7E9G6,8A12D11,and 9H10F5 monoclonal antibodies,respectively.识别不同H5亚型的HA蛋白，且荧光强度高，反应性良好。以上结果显示，5株单克隆抗体能够特异性识别H5亚型禽流感病毒HA蛋白。ANC.1 23.41H12B970 ku2A9D1170ku7E9G670ku8A12D1070ku9H10F570kuBNC1H12B92A9D117E9G68A12D109H10F52图2 单克隆抗体的特异性鉴定Figure 2 Specificity identification of monoclonal antibodiesA：W e s t e r n-b l o t 检测（NC：空载体pRK对照；l:pRK-SC15-HA质粒转染表达蛋白；2:pRK-QH448-HA质粒转染表达蛋白；3:pRK-SZ19-HA质粒转染表达蛋白；4:pRK-GD306-HA质粒转染表达蛋白）。B：间接免疫荧光检测（NC：阴性对照；1:DAPI;2:H5N8-QH448-HA蛋白）。A:Western-blot assay(NC:pRK vector;l:Transfected the expressed proteins with the plasmid pRK-SC15-HA;2:Transfected the expressed proteinswith the plasmid pRK-QH448-HA;3:Transfected the expressed proteins with the plasmid pRK-SZ19-HA;4:Transfected the expressed proteins withthe plasmid pRK-GD306-HA).B:Indirect immunofluor-escence assay(NC:Negative control;1:DAPI;2:H5N8-QH448-HAprotein).16第54卷中国兽医科学2.4单克隆抗体识别表位的鉴定通过IPTG诱导，收取诱导前后的样品进行SDS-PAGE分析。第1轮筛选表位识别中构建的重组质粒截短体均能表达，并且表达的蛋白大小符合预期。Western-blot鉴定所用的一抗为纯化后的单克隆抗体以及小鼠Anti-GST抗体。如表2 所示：3种单克隆抗体1H12B9、2 A 9D 11和7 E9G6识别的抗原表位位于HA1301345a a 之间，8 A12D10单克隆抗体识别的抗原表位位于HA1251300aa之间，9H10F5单克隆抗体识别的抗原表位为12 1136aa，即12 1LSRINHFEKILIIPKS136肽段。第2 轮鉴定出的抗原表位：1H12B9和7 E9G6识别的抗原表位为HA1蛋白的330 ATGLRNSPLREKRRKR345肽段；2A9D11和8 A12D10识别的抗原表位分别为HA1表2 5株单克隆抗体识别表位的第1轮鉴定Table2Identification of 5 monoclonal antibodies recogni-tion epitope in first-round编号Anti-位点Site11H12B92A9D117E9G68A12D109H10F5No.GSTFO1345aa+F11106aa一一+F21121aa+F31136aa+F41181aa+F51200aa一+F61250aa+F71300aa+F851345aa+F9101345aa+F10151345aa+一+F11210345aa+阳性；-：阴性。+:Positive;-:Negative.蛋白的310 IHPLTIGECPKYVKSN325和2 7 1KIVKKGDST-IMKSEV285月肽段(见图3）2.5抗原表位的同源性分析从GenBank数据库中下载2 36 5条H5亚型HA1蛋白序列，与筛选出的抗原表位所在肽段进行比对。1H12B9和7 E9G6识别的位置位于HA1330345a a 之间，但338 之后为裂解位点，因此未对340 位点以后的氨基酸的同源性进行比较，8A12D10识别的位置位于HA12712 8 5a a 之间，其中H5序列中2 7 4和2 7 5位氨基酸主要为精氨酸(99.9%），而病毒蛋白HA1的序列为赖氨酸(0.1%）。精氨酸和赖氨酸均属于碱性氨基酸。结果显示筛选出的4个抗原表位在H5亚型中均高度保守（见表3）。A12341H12B925kuB7E9G625ku12342A9D11.25ku8A12D1025kuGST25kuGST25ku图3#抗原表位的进一步筛选Figure 3Analysis of antigenic epitopesA:1H12B9、7 E9G 6 和2 A9D11单抗识别表位的第2 轮筛选（1:30 1315aa;2:310325aa;3:320335aa;4:330345aa)。B:8 A 12 D 10单抗识别表位的第2 轮筛选（1:2 512 6 5aa;2:261275aa;3：271285 aa;4:281300 aa)。A:The second round identification of epitopes recognized by 1H12B9,7E9G6 and 2A9D11 monoclonal antibodies.(1:301315 aa;2:310325aa;3:320335aa;4:330345aa).B:The second round identifi-cation of epitopes recognized by 8A12D10 monoclonal antibody.(1:251265.aa;2:261275aa;3:271285aa;4:281300aa).表3单克隆抗体识别的抗原表位同源性比较Table33Analysis of epitope homology for monoclonal antibody recognition330340aa310325aa27185aa121136aa位置同源性%位置同源性%位置同源性%位置同源性%aaaaaaaaLocationHomologyLocationHomologyLocationHomologyLocationHomology330A99.931098.1271K99.1121L98.1331T99.7311H99.9272199.4122S99.4332G100.0312P99.9273V97.6123R92.2333L99.6313L96.6274K0.1124I91.8334R99.9314T99.8275K0.1125N98.6335N99.9315199.5276G99.2126H98.7336S83.6316G100.0277D97.5127F98.6337P99.9317E99.8278S99.3128E99.2338L23.6318C99.7279T68.6129K99.2339R90.0319P99.9280198.213086.5340E98.9320K99.2281M98.1131L15.5321Y99.8282K79.0132I99.9322V99.8283S99.0133I96.4323K99.7284E93.6134P99.5324S98.9285V94.6135K89.5325N86.5136S65.2aa氨基酸。aa:Aminoacid.17第1期汪亮等：H5N8亚型禽流感病毒HA1蛋白的抗原表位鉴定使用Pymol软件对不同表位在H5亚型禽流感病毒HA蛋白三聚体上的位置进行定位，结果发现4种抗原表位都暴露于HA三聚体结构的表面（见图4)。1H12B9:330ATGLRNSPLREKRRKR3452A9D11:310IHPLTIGECPKYVKSN3258A12D10:71KIVKKGDSTIMKSEVISS9H10F5:I2ILSRINHFEKILIPKS136图44种抗原表位在H5亚型禽流感病毒HA蛋白上的定位Figure 4Localization of 4 epitopes on HA trimer of H5subtype avian influenza virus3讨论禽流感在流行过程中，禽流感病毒在宿主体内中和抗体的免疫压力下会出现抗原变异株 15。HA1蛋白比其他蛋白更容易发生突变和抗原漂移。H5N8亚型禽流感病毒自传入我国以来，在全国范围内先后使用了重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗(H5N1Re-11株、Re-12株和H7N9Re-3株）16|和三价灭活疫苗（H5Re-13,、H 5R e-14和H7Re-4)17,使动物能够抵御Clade2.3.4.4b的H5N1、H 5N6 和H5N8亚型禽流感病毒株的攻击，为家禽提供保护力。尽管禽流感病毒容易变异，但是流感病毒中保守蛋白和保守的线性表位筛选是研究广谱疫苗的一个可能的途径。目前，以禽流感病毒保守的线性表位为靶标研制的广谱疫苗，通常会加人多个蛋白中保守的线性表位共同作用以达到更好的交叉保护效果【18。通过对抗原表位的筛选、优化组合、串联方式和佐剂的筛选等各方面进行综合考虑，禽流感广谱疫苗具有广阔的开发和应用前景。决定检测效率的关键是方法的敏感性与特异性。针对特异性抗原表位的单克隆抗体可作为筛选特异性抗原的高效工具，而同时使用多个特异性表位可提高检测方法的敏感性。用双抗体夹心法选择识别不同抗原表位的2 个单克隆抗体，分别用于包被固相载体和制备酶结合物，具有很高的特异性。Ming等【191利用识别2 个不同表位的单克隆抗体4D10和5G2，以抗体4D10为捕获抗体、HRP标记的5G2为检测抗体建立了双抗体夹心法，能够特异性地检测H9N2亚型禽流感病毒，该双抗体夹心法的敏感性和特异性分别为98.9%和98.1%。本研究筛选出的5株单克隆抗体可以特异性地识别Clade2.3.4.4的H5亚型HA蛋白，其抗原表位在H5HA序列中高度保守。后续可以这5株单克隆抗体为基础，构建快速、可靠的检测技术，有助于H5亚型禽流感病毒的监测总的来说，本研究筛选出了5株抗QH448(H5N8)HA1蛋白的单克隆抗体(分别命名为1H12B9、2A9D11、7 E9G 6、8 A 12 D 10 和9H10F5），进一步研究发现这5株单克隆抗体的特异性良好，其靶序列高度保守，为H5N8亚型禽流感毒株的检测提供了新的靶标抗体，也对H5N8亚型禽流感病毒的防控具有一定的科学意义。参考文献(References)1 LI K S,GUAN Y,WANG J,et al.Genesis of a highlypathogenic and potentially pandemic 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