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基于网络药理学-分子对接的藤椒精油抗解淀粉芽孢杆菌生物被膜机理.pdf
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1、第 41 卷 第 6 期2023 年 11 月食 品 科 学 技 术 学 报Journal of Food Science and TechnologyVol.41 No.6Nov.2023doi:10.12301/spxb202300003文章编号:2095鄄6002(2023)06鄄0088鄄15引用格式:张莹凡,吕昕昱,肖瑀晗,等.基于网络药理学-分子对接的藤椒精油抗解淀粉芽孢杆菌生物被膜机理J.食品科学技术学报,2023,41(6):88-102.ZHANG Yingfan,L譈 Xinyu,XIAO Yuhan,et al.Study on antibiofilm mechanism
2、 of Zanthoxylum armatum essential oilagainst Bacillus amyloliquefaciens based on network pharmacology and molecular dockingJ.Journal of Food Science andTechnology,2023,41(6):88-102.基于网络药理学-分子对接的藤椒精油抗解淀粉芽孢杆菌生物被膜机理张莹凡,摇 吕昕昱,摇 肖瑀晗,摇 杨摇 露,摇 申光辉*(四川农业大学 食品学院/农业农村部农产品加工与营养健康重点实验室(部省共建),四川 雅安摇 625014)摘摇 要:
3、为探讨藤椒精油抗解淀粉芽孢杆菌生物被膜的关键活性分子及其胞内作用机理,采用PharmMapper 数据库进行靶点预测,结合基因组注释信息对筛选后的靶点进行清洗过滤,预测筛选藤椒精油关键活性组分及抗生物被膜的作用靶点,并应用 Cytoscape 软件构建藤椒精油活性分子-潜在靶点互作网络,通过 String 数据库对潜在靶点进行 GO 与 KEGG 通路富集分析。应用STITCH 数据库获得潜在靶点互作关系,Cytoscape 软件进行网络拓扑分析,筛选关键核心靶点。采用 CB鄄DOCK2 在线分子对接服务器进行藤椒精油活性分子与核心靶点的分子对接。最后通过离体培养结合结晶紫染色法、细菌运动能力
4、实验验证藤椒精油关键活性分子的抗生物被膜活性。结果表明,通过网络药理学方法共筛选获得了 21 种藤椒精油活性组分,133 个潜在作用靶点,8 个核心靶点。GO 富集分析共获得 17 个 GO 二级条目,包括生物学过程条目 6 个、分子功能条目 8 个和细胞组分条目 3 个。KEGG 通路富集分析共获得 8 条信号通路,涉及次级代谢产物的生物合成、氨基酸的生物合成等通路。分子对接结果表明,藤椒精油关键活性组分中桉叶醇、金合欢醇乙酸酯、反式法尼醇可通过氢键和疏水相互作用等分子间作用力与核心靶点 OdhA、CarB、PurF 紧密结合并形成稳定构象。离体生物被膜培养验证实验结果表明,0郾 32 1郾
5、 28 滋L/mL 的金合欢醇乙酸酯、反式法尼醇对解淀粉芽孢杆菌均有显著的抗生物被膜活性。研究结果旨在为藤椒精油抗细菌生物被膜的胞内分子机理提供新的研究思路。关键词:网络药理学;分子对接;生物被膜;藤椒精油;解淀粉芽孢杆菌中图分类号:TS201郾 3摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码:A收稿日期:20230102基金项目:国家级大学生创新训练计划项目(202210626040);四川省科技成果转移转化示范项目(2022ZHSF0064);雅安市创建国家现代农业产业科技创新中心“揭榜挂帅冶项目(KCZX2023-2025-07)。Foundation:National College Student
6、s蒺 Innovation and Entrepreneurship Training Program(202210626040);Sichuan Province Science and TechnologyAchievement Transfer and Transformation Demonstration Project(2022ZHSF0064);Open Competition Program of creation of YaanNational Modern Agricultural Industry Science and Technology Innovation Cen
7、ter(KCZX2023-2025-07).第一作者:张莹凡,女,本科生,研究方向为食品微生物安全控制。摇*通信作者:申光辉,男,副教授,博士,主要从事食品微生物安全控制方面的研究。摇 摇 生物被膜是细菌菌体被自分泌的胞外多糖、蛋白质、核酸等基质大分子聚合物包裹构成的高度结构化的细菌群体1,难以彻底杀灭和清除,给食品安全生产和流通带来严重威胁2。因此,开发高效88安全的生物被膜控制技术,对保障食品安全生产和品质稳定具有重要意义。植物精油作为天然来源的抗菌分子资源,在食品抗菌保鲜技术领域备受关注3-4。藤椒是花椒属竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC.)的果实,富含芳樟醇、柠檬
8、烯等组分。藤椒精油具有良好的抗菌抗生物被膜活性。Manoharan 等5研究发现,芳樟醇可抑制白色念珠菌生物被膜的形成;Park 等6发现,桧烯通过抑制致龋毒力因子来抑制变形链球菌的生物被膜及其细胞黏附能力;Subramenium 等7证实了柠檬烯通过结合链球菌表面相关毒力因子来抑制生物被膜的形成。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DY1a 是非发酵豆制品的优势腐败菌,具有抗逆性强8、代谢产生有毒生物胺9、生物被膜形成速度快10等特点,给生产设备清洗消毒和产品贮藏安全带来了严重威胁。本团队前期研究表明,藤椒精油对解淀粉芽孢杆菌 DY1a 生物被膜的形成具有良好
9、的抑制效果11,但由于藤椒精油的组分复杂性及细菌生物被膜调控通路的多样性,目前对藤椒精油抗细菌生物被膜的分子作用机理了解不够深入。分子对接是采用计算机辅助分子模拟技术,对活性小分子与靶点分子之间的作用模式、结合位点和影响因素等进行预测的虚拟研究手段12。网络药理学是以系统生物学等多学科为理论基础,利用互作网络和可视化等技术揭示生命活动与活性药物分子之间互作机理的学科13-14。网络药理学结合分子对接技术在药物靶点发现、活性物质筛选及功能食品分子挖掘等领域凸显出良好的方法学优势15-16。本研究拟借助网络药理学和分子对接技术,揭示藤椒精油抑制解淀粉芽孢杆菌生物被膜的关键潜在活性分子及其胞内作用靶
10、点,并验证关键小分子的抗生物被膜活性,以解析藤椒精油抗细菌生物被膜的作用机制。1摇 材料与方法1郾 1摇 材料与试剂解淀粉芽孢杆菌 DY1a,四川农业大学食品学院。氯化钠、甲醇、结晶紫、草酸铵、无水乙醇、冰乙酸、吐温鄄80,均为分析纯,成都市科隆化学品有限公司;金合欢醇乙酸酯(色谱纯)、反式金合欢醇(色谱纯),上海迈瑞尔生化科技有限公司。肉汤培养基(LB)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基,青岛海博生物技术有限公司。1郾 2摇 仪器与设备ZWY-211B 型恒温摇床,上海智城分析仪器制造有限公司;QL-901 型涡旋仪,江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司;ST16R 型高速冷冻离心机、Vari
11、oskan Flash 型荧光酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司;SW-CJ-2FD 型超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司。1郾 3摇 实验方法1郾 3郾 1摇 藤椒精油主要组分的收集整理以“Zanthoxylum armatum DC.essential oil冶 和“藤椒精油冶为主要关键词检索中外相关研究文献,整理收集后得到藤椒精油小分子相关信息,通过Pubchem 数据库(https:椅pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载小分子 sdf 格式文件,构建藤椒精油主要组分数据库。1郾 3郾 2摇潜在靶点的筛选与小分子-潜在靶点互作网络的构建将藤椒精油小分子 sdf 格式文件
12、上传至 Pharm鄄Mapper 反向对接服务器(http:椅www.lilab鄄 fit score)大于 0郾 4 为选择指标进行潜在作用靶点初筛,STITCH 数据库(http:椅stitch.embl.de/)寻找靶点作补充。通过 UniProt 数据库(https:椅www.uniprot.org/)查找筛选结果的基因名(gene name)。通 过 产 生 物 被 膜 菌 株 Bacillusamyloliquefaciens L-17 基因组(https:椅www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP074391.1)17进一步查询筛选得到与解淀粉芽孢杆菌有关的
13、靶点。根据藤椒精油小分子与潜在靶点的关系制作网络(network)文件和类型(type)文件,将 2 个文件导入 Cytoscape 软件绘制 PPI(蛋白相互作用)网络。1郾 3郾 3摇 KEGG 和 GO 靶点通路分析通过 STRING 数据库(https:椅string鄄db.org/)进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集,分析藤椒精油小分子与靶点结合过程中可能影响的生物学过程(biological process,BP)、细胞组分(cell compo鄄nent,CC)和分子功能(molecular function,MF)。通过京都基因和基因组百科全书(kyoto
14、 encyclopediaof genes and genomes,KEGG)通路分析,获得藤椒精油小分子与靶点结合过程中的潜在信号通路。使用98第 41 卷 第 6 期张莹凡等:基于网络药理学-分子对接的藤椒精油抗解淀粉芽孢杆菌生物被膜机理Chiplot 在线可视化工具(https:椅www.chiplot.on鄄line/)绘制 GO 功能富集与 KEGG 通路分析气泡图。1郾 3郾 4摇 核心靶点的筛选将潜在靶点导入 STITCH(http:椅stitch.embl.de/)数据库,以置信度大于 0郾 9 为选择指标16,得到潜在靶点分子相互作用的网络关联图,下载 tsv格式文件导入 C
15、ytoscape 3.7.2 软件,通过互作网络拓扑分析获得潜在靶点的节点度值、特征向量中心性、介数中心度和接近中心度的平均值,以大于各节点的平均值为标准获得核心靶点。1郾 3郾 5摇 藤椒精油小分子与核心靶点的分子对接通过 UniProt 数据库获取核心靶点的一级结构序列信息,提交至 SWISS鄄MODEL 在线服务器(ht鄄tps:椅swissmodel.expasy.org/)进行靶点蛋白 3D 建模。以核心靶点为受体,藤椒精油小分子为配体,利用基于 AutoDock Vina 软件的 CB鄄DOCK2 在线分子对接服务器(https:椅 RDKit生成初始 3D 构象。受体蛋白质缺失的
16、侧链原子和氢原子的添加,去除结晶水等操作均由在线服务器采用 OpenBabel 和 MGL 程序工具自动处理18。对接结合能以 AutoDock Vina score 函数19计算并表示,单位kJ/mol。采用 Discovery Studio 2021 对最佳对接复合物进行相互作用分析和可视化20。1郾 3郾 6摇 潜在小分子抗生物被膜活性的验证1郾 3郾 6郾 1摇 培养基制备TSBS 培养基:A 液为胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基(30郾 0 g/L),B 液为豆浆粉(50郾 0 g/L)。将灭菌后的 A、B 液按体积比 1颐 1混合均匀。A 液121 益灭菌 15 min,B 液 1
17、15 益灭菌 20 min。1郾 3郾 6郾 2摇 细菌生物被膜的培养将本课题组实验室保存的解淀粉芽孢杆菌DY1a8接种至 LB 培养基,37 益、160 r/min 振荡培养 24 h,4 益、4 000 r/min 离心 10 min,弃去培养基,PBS 缓冲液轻轻冲洗菌体沉淀 3 次,并调节菌悬液600 nm 吸光度至 0郾 10。根据小分子化合物与靶点的结合能力,综合考虑小分子化合物的可获得性,选择金合欢醇乙酸酯和反式法尼醇进行抗生物被膜活性验证。用体积分数 0郾 20%的吐温鄄80 进行乳化,分别加入到灭菌 TSBS 培养基11,再接入制备好的菌悬液,使 2 种小分子化合物最终添加体
18、积比分别为 0郾 32、0郾 64、1郾 28 滋L/mL,初 始 接 菌 量 为106CFU/mL,同时以未添加精油组分培养体系为对照组,用涡旋仪混合均匀后分装至 5 mL 的灭菌小烧杯,用封口膜封口,37 益静置培养 48 h,观察生物被膜形成情况并拍照。1郾 3郾 6郾 3摇 生物被膜的定量检测参考 Stepanovic 等21的方法并略加修改。将烧杯内菌液吸弃,用生理盐水轻轻冲洗生物被膜 2 次,加入 2 mL 甲醇固定 15 min,吸弃甲醇。生理盐水冲洗 1 次,加入 1 mL 质量分数 0郾 10%的结晶紫染色5 min,吸弃结晶紫染色液,生理盐水冲洗 2 次,再加入3 mL 体
19、积分数33%的乙酸溶液,静置24 h。转移200 滋L 反应液至 96 孔板,酶标仪检测 595 nm 处吸光度,不同处理组均重复 3 次。1郾 3郾 6郾 4摇 细菌运动能力测定参考杨露等10的方法并略加修改。配制金合欢醇乙酸酯和反式法尼醇添加体积比分别为 0郾 32、0郾 64、1郾 28 滋L/mL 的泳动、丛集 TSB 培养基,泳动培养基琼脂质量分数为 0郾 475%,丛集培养基琼脂质量分数为 0郾 600%,同时以未添加精油组分的 TSB培养基为对照组。泳动实验:待泳动培养基凝固后,在培养基中心滴入 5 滋L 106CFU/mL的菌悬液,待菌液吸干,37 益 培养 24 h,测量泳动
20、圈直径大小。丛集实验:待丛集培养基凝固后,用接种针挑取少量单菌落刺入培养基中心,37 益培养 24 h,测量泳动圈直径大小,并按式(1)计算藤椒精油小分子对细菌泳动或丛集运动的抑制率。抑制率=A1-A2A1伊100%摇。(1)式(1)中,A1为对照组泳动或丛集圈面积;A2为处理组泳动或丛集圈面积。1郾 4摇 数据处理所得数据利用 IBM SPSS 20郾 0 软件进行显著性分析,P 0郾 05 表示存在显著性差异。采用 Cytoscape软件绘制互作网络,采用 Chiplot 在线可视化工具绘制富集分析图和分组对接结合能的 2D 热图,采用Origin Pro 2019 软件绘制生物被膜定量实
21、验结果。2摇 结果与分析2郾 1摇 藤椒精油主要组分通过 Web of Science 和 CNKI 等国内外学术文献数据库检索整理,共收集到 60 种藤椒精油组分,见表 1。09食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月表 1摇 藤椒精油主要化学组分Tab.1摇 Main components of Zanthoxylum armatum DC.essential oil序号化合物名称分子式CAS 号1亚麻酸甲酯C19H32O2301鄄00鄄82棕榈酸乙酯C18H36O2628鄄97鄄73金合欢醇乙酸酯C17H28O229548鄄
22、30鄄94棕榈酸C16H32O21957鄄10鄄35棕榈烯酸C16H30O2373鄄49鄄96十六烷C16H34544鄄76鄄37橙花叔醇C15H26O40716鄄66鄄38桉叶醇C15H26O1209鄄71鄄89榄香醇C15H26O639鄄99鄄610反式法尼醇C15H26O106鄄28鄄511氧化丁香烯C15H24O1139鄄30鄄612茁鄄榄香烯C15H2433880鄄83鄄013琢鄄荜澄茄油烯C15H2417699鄄14鄄814葎草烯C15H246753鄄98鄄615酌鄄杜松烯C15H241460鄄97鄄516啄鄄杜松烯C15H24483鄄76鄄117(E)鄄石竹烯C15H24118鄄
23、65鄄018石竹烯C15H2487鄄44鄄519(Z)鄄水化香桧烯C12H20O277318鄄48鄄020乙酸芳樟酯C12H20O2115鄄95鄄721乙酸香叶酯C12H20O2105鄄87鄄322云实素C10H12O490鄄24鄄423琢鄄松油醇C12H20O280鄄26鄄224乙酸桃金娘烯酯C12H18O235670鄄93鄄025香茅酸C10H18O2502鄄47鄄626甲基正壬酮C11H22O112鄄12鄄927桂皮酸甲酯C10H10O2103鄄26鄄428槲皮素C10H18O29803鄄81鄄429薄荷醇C10H18O16721鄄38鄄330(E)鄄4鄄侧柏醇C10H18O15537鄄
24、55鄄0序号化合物名称分子式CAS 号312鄄莰醇C10H18O10385鄄78鄄132松油烯醇C10H18O562鄄74鄄333桉叶油醇C10H18O470鄄82鄄634香叶醇C10H18O106鄄24鄄135松油醇C10H18O98鄄55鄄536芳樟醇C10H18O78鄄70鄄637水芹醛C10H16O21391鄄98鄄038柠檬醛C10H16O5392鄄40鄄539桃金娘烯醇C10H16O515鄄00鄄440薄荷酮C10H16O89鄄81鄄6414鄄乙烯基愈创木酚C9H10O27786鄄61鄄042对百里酚C10H14O3228鄄2鄄243枯茗醇C10H14O536鄄60鄄744香芹酮C
25、10H14O99鄄49鄄045茴香醚C10H12O4180鄄23鄄846枯茗醛C10H12O122鄄03鄄247壬醛C9H18O124鄄19鄄648隐酮C9H14O500鄄02鄄749侧柏烯C10H1628634鄄89鄄150罗勒烯C10H163779鄄61鄄151桧烯C10H163387鄄41鄄552异松油烯C10H16586鄄62鄄953柠檬烯C10H16138鄄86鄄354月桂烯C10H16123鄄35鄄355琢鄄萜品烯C10H1699鄄86鄄556萜品烯C10H1699鄄85鄄457水芹烯C10H1699鄄83鄄258莰烯C10H1679鄄92鄄559对伞花烃C10H1499鄄87鄄6
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