单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究.pdf
《单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究.pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45,No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202302005单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究曾成容1,刘馨1,张晨旭1,毕文文1,梅世慧1,何广霞1,张峻杰1,文明1,2*,周碧君1,2*,陈江凤1,2,姜海波1,2(1.贵州大学 动物科学学院,贵州 贵阳 550025;2.贵州省动物生物制品工程技术研究中心,贵州 贵阳 550025)摘要:嗜水气单胞菌作为水产养殖业中的主要病原菌,严重危害该产
2、业的发展。为探究单宁酸对嗜水气单胞菌的抑菌作用及其转录组的影响,本实验将单宁酸2倍倍比稀释(8滋g/mL8 192滋g/mL)后,测定单宁酸对嗜水气单胞菌ATCC 7966株的最小抑菌浓度(MIC);将嗜水气单胞菌分别与不同浓度的单宁酸共培养,根据所测细菌OD600nm值(共测24 h),绘制细菌的生长曲线。结果显示,单宁酸对嗜水气单胞菌的MIC为2 048滋g/mL;浓度低于64滋g/mL(临界值)单宁酸处理后不影响嗜水气单胞菌的生长。因此本实验采用64滋g/mL的单宁酸与嗜水气单胞菌ATCC 7966株共培养,每组重复4次,12 h后提取各组嗜水气单胞菌总RNA,反转录为cDNA后构建cD
3、NA文库,再利用随机引物,经PCR扩增、定量后,采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。通过计算每个样品中rRNA的占比(rRNA%)及碱基的错误率对测序数据质控;采用Bowtie2将获得的各组嗜水气单胞菌测序数据与GenBank中嗜水气单胞菌ATCC 7966株参考基因组比对,分析它们之间的相似性。结果显示,各组测序样品的rRNA%和碱基错误率均分别低于0.8%和0.024%,且与参考基因组的相似性均大于99%,表明测序数据可靠,可以用于后续分析。采用edgeR、DESeq2和DESeq软件筛选并分析各组嗜水气单胞菌转录水平差异及显著差异的基因,采用Goat
4、ools和KOBAS软件对转录水平显著差异基因进行GO功能注释与KEGG信号通路的富集分析,利用RT-qPCR对转录水平显著上调和显著下调的各4个基因验证。结果显示:与对照组相比,单宁酸处理组嗜水气单胞菌中转录水平显著上调的基因144个,显著下调的基因104个,转录水平显著变化的基因主要集中在嗜水气单胞菌的VI型分泌系统(T6SS)、铁调控和TonB系统、ABC转运蛋白系统相关蛋白的编码基因。GO功能注释结果显示,单宁酸处理嗜水气单胞菌后共显著富集到88个GO term,38个生物学过程(BP)、10个细胞组分(CC)、40个分子功能(MF),主要涉及蛋白质折叠、亮氨酸生物合成和代谢、铁载体生
5、物合成和代谢、铁硫簇结合、金属簇结合、铁载体跨膜转运活性等。KEGG富集分析结果显示,单宁酸处理嗜水气单胞菌后的转录显著差异基因富集到5条信号通路,包括铁载体蛋白生物合成、硫胺素代谢、C5-支链二元酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成及脂质与动脉粥样硬化等。RT-qPCR验证结果显示,RNA-Seq与RT-qPCR结果基本一致。本研究首次分析了单宁酸处理嗜水气单胞菌后的转录组数据的变化,证实单宁酸主要影响嗜水气单胞菌支链氨基酸、铁载体及硫胺素的生物合成和代谢等信号通路,从而影响该菌的生理生化功能甚至毒力。本研究为全面探究单宁酸在防治嗜水气单胞菌感染中的作用及作用机制奠定了实验基础,同时也
6、为探寻嗜水气单胞菌抗生素的替代品提供新思路。关键词:嗜水气单胞菌;单宁酸;转录组中图分类号:S852.61文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)09-0895-10Effect of tannic acid on the transcriptome of收稿日期:2023-02-11基金项目:贵州省科技计划项目(黔科合支撑20201Y104号、黔科合支撑2022YB142号)作者简介:曾成容(1998-),女,贵州桐梓县人,硕士研究生,主要从事动物疫病诊断与兽医微生物学方向研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding author嗜水气单胞菌()作为可运动的革
7、兰氏阴性菌,广泛分布于各种水生环境中,感染鱼类、两栖动物、爬行动物和哺乳动物后引起败血症、肠炎等,是一种典型的人兽共患病原菌1。ZENG Cheng-rong1,LIU Xin1,ZHANG Chen-xu1,BI Wen-wen1,MEI Shi-hui1,HE Guang-xia1,ZHANG Jun-jie1,WEN Ming1,2*,ZHOU Bi-jun1,2*,CHEN Jiang-feng1,2,JIANG Hai-bo1,2(1.College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Guizhou
8、 Animal Biological Products Engineering Technology Research Center,Guiyang 550025,China)Abstract:,as a major pathogen in aquaculture,seriously jeopardizes the development of the industry.Toinvestigate the antibacterial effect of tannic acid onand its transcriptome,the minimum inhibitoryconcentration
9、(MIC)of tannic acid onATCC 7966 strain was determined after 2-fold serial dilution(8滋g/mL-8192滋g/mL)of tannic acid;was co-cultivated with different concentrations of tannic acid,and thegrowth curves were plotted according to the measured OD600nmvalues of the bacteria(measured for 24 hours).The resul
10、ts showedthat the MIC of tannic acid forwas 2048滋g/mL,tannic acid treatment at concentrations below 64滋g/mL didnot affect the growth of.Therefore,strain ATCC 7966 was co-culture with 64滋g/mLtannic acid,and each group was replicated four times.After 12 hours,the total RNA ofin each group wasextracted
11、 and reverse transcribed to construct a cDNA library,and then the transcriptomes were sequenced using the IlluminaHiSeq sequencing platform after PCR amplification and quantification using random primers.The quality control of sequencingdata was performed by calculating the percentage of rRNA(rRNA%)
12、and the error rate of bases in each sample.The sequencingdata ofin each group were compared with the reference genome ofATCC 7966strain in GenBank by Bowtie2 to analyze the similarity between them.The results showed that the rRNA%and base error rates ofeach group of sequenced samples were lower than
13、 0.8%and 0.024%,and the similarity with the reference genome was more than99%,indicating that the sequencing data were reliable and could be used for subsequent analysis.The edgeR,DESeq2 and DESeqsoftware were used to screen and analyze the genes with different and significantly different transcript
14、 levels in each group of,the Goatools and KOBAS software were used to perform GO functional annotation and KEGG signalingpathway enrichment analysis on genes with significant differences in transcript levels,and RT-qPCR was used to verify the fourgenes with significantly up-regulated and significant
15、ly down-regulated transcription levels.The results showed that compared withthe control group,144 genes were significantly up-regulated and 104 genes were significantly down-regulated in the tannicacid-treated group,and the genes with significant changes in transcription levels were mainly concentra
16、ted in the coding genes ofT6SS secretion system,the iron-regulated and TonB systems,and the ABC transporter system.GO functional annotation resultsshowed that a total of 88 GO terms,38 biological processes(BP),10 cellular components(CC),and 40 molecular functions(MF)were significantly enriched after
17、 tannic acid treatment of,mainly including protein folding,leucinebiosynthesis and metabolism,siderophore biosynthesis and metabolism,iron-sulfur cluster binding,metal-cluster binding,andsiderophore transmembrane transporter activity.KEGG enrichment analysis results showed that the differentially tr
18、anscribed genesafter tannic acid treatment ofwere significantly enriched into five signaling pathways,including siderophoreprotein biosynthesis,thiamine metabolism,C5-branched chain dicarboxylic acid metabolism,and biosynthesis of valine,leucine,and isoleucine lipids and atherosclerosis.The results
19、of the RT-qPCR verification showed the basic consistency between the tworesults.In this study,the changes of transcriptomic data after tannic acid treatment ofwere analyzed for thefirst time,confirming that tannic acid mainly affected the signaling pathways such as the biosynthesis and metabolism of
20、branched-chain amino acids,siderophore,and thiamine in,which in turn affected the physiological andbiochemical functions and even the virulence of the bacteria.This study laid an experimental foundation for comprehensivelyexploring the role and mechanism of tannic acid in the prevention and treatmen
21、t ofinfection,and alsoprovided new ideas for exploring alternatives to antibiotics against.Key words:;tannic acid;transcriptome中 国 预 防 兽 医 学 报2023年896曾成容,等.单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究第9期897其是一种条件致病菌,携带多种毒力因子,如II型、III型和VI型分泌系统(分别为T2SS、T3SS和T6SS)、外毒素和内毒素等2。其中由该菌引起的运动性气单胞菌败血症对水产养殖业危害极大,近年来给我国的水产养殖行业造成了严重的经济损失3。
22、目前由嗜水气单胞菌感染造成的疾病主要依靠抗生素治疗,但由于抗菌药物的不合理使用甚至滥用、耐药菌株的传播及耐药基因的水平转移,导致嗜水气单胞菌的耐药性问题日益凸出4-5。因此迫切需要绿色、安全、高效的抗生素替代物来防治嗜水气单胞菌的感染。单宁酸(Tannic acid)是一种复杂的多酚有机物,它在酸、碱和酶的作用下释放没食子酸和葡萄糖,在水中具有高溶解度,是安全的食品添加剂6。单宁酸存在于许多植物和人类饮食中,如水果、葡萄酒、啤酒、茶、咖啡、谷物、坚果等中,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等作用7。已发现单宁酸作为一种有效的群体感应抑制剂(QSI),通过抑制细菌生物被膜的形成和群体感应系统减弱细菌
23、的毒力8。但关于单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究较少。RNA转录组学测序(RNA-seq)具有测序速度快、分辨率高等优点,现已被广泛应用9。因此,本实验在证明单宁酸能够抑制嗜水气单胞菌生长的前提下,将单宁酸与嗜水气单胞菌共培养,并以不加入单宁酸的嗜水气单胞菌作为对照,24 h后利用RNA-seq对各组嗜水气单胞菌测序,筛选两组细菌中转录水平显著差异的基因,并对转录显著差异基因进行GO功能注释和KEGG信号通路的富集分析,为单宁酸对嗜水气单胞菌抑菌机制及防治嗜水气单胞菌感染的抗生素替代药物的研究提供参考和新思路。1材料与方法1.1菌株及试剂嗜水气单胞菌ATCC 7966株购自宁波明舟生物科技
24、有限公司。单宁酸(97.5%)购自上海麦克林生化科技股份有限公司;NB培养基购自杭州微生物试剂有限公司;TruSeq RNA文库构建试剂盒购自Illumina公司;核糖体RNA去除试剂盒购自Epicenter公司;SuperScriptTM双链cDNA合 成 试 剂盒、末端修复混合液购自Invitrogen公司;PhusionDNA聚合酶购自New England Biolabs公司;脱氧核糖核酸酶I、总RNA提取试剂、去基因组RT-PCR反转录试剂和RT-PCR反应试剂均购自TaKaRa公司。1.2单宁酸对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)和生长曲线的测定取嗜水气单胞菌ATCC 7966株
25、于NB培养基中过夜培养12 h(28、170 r/min)。将单宁酸分别以8 192滋g/mL、4 096滋g/mL、2 048滋g/mL、1 024滋g/mL、512滋g/mL、256滋g/mL、128滋g/mL、64滋g/mL、32滋g/mL、16滋g/mL、8滋g/mL的终浓度加入96孔板中,再将嗜水气单胞菌菌液按1伊106cfu/mL的量加入各浓度的单宁酸中,同时设置阳性对照组(仅加细菌和培养基)和溶剂对照组(加DMSO、细菌和培养基)以及空白对照组(不加菌液),所有组均设置3个重复,28培养24 h通过肉眼观察结果。以没有明显细菌生长的浓度为该菌的MIC。将嗜水气单胞菌过夜培养,将新
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 单宁酸 水气 单胞菌 转录 影响 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。