FSTL3在不同诱因所致的小鼠急性肺损伤中的表达.pdf
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1、基础研究FSTL3 在不同诱因所致的小鼠急性肺损伤中的表达黄丽丹1,王博2(武汉大学人民医院:1麻醉科,2胸外科,武汉 430060)【摘 要】目的 探讨人卵泡抑素样蛋白 3(FSTL3)在不同诱因所致的小鼠急性肺损伤中的表达及其意义。方法采用腹腔注射脂多糖(LPS)构建脓毒血症肺损伤模型,采用左肺门夹闭后开放的方式构建缺血再灌注(IR)损伤模型。检测肺损伤不同时间点小鼠血清中 FSTL3 的蛋白表达水平,肺组织中 FSTL3 的蛋白及 mRNA 表达水平。使用 FSTL3 中和抗体(FSTL3-NA)或 FSTL3 基因敲除小鼠评估 FSTL3 抑制对两种诱因所致的小鼠肺损伤的影响。使用免疫
2、印记法检测小鼠肺组织中肿瘤坏死因子-(TNF-),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),超氧化物歧化酶(SOD)1 和 SOD2 的蛋白表达水平。应用 GraphPad Prism 9.2 统计软件对数据进行分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用 t 检验。结果 小鼠血清中 FSTL3的蛋白表达水平于 LPS 腹腔注射后 12h 显著升高,18h 达到峰值,后趋于稳定,均显著高于 0h(P0.05);缺血 2h,再灌注 2 h 后小鼠血清中 FSTL3 蛋白表达水平显著升高,再灌注 6 h 达到峰值,8 h 后蛋白表达水平仍显著高于 0 h(P0.05)。Western bl
3、otting 和转录实时定量聚合酶链反应显示,LPS 刺激 18 h 后小鼠肺组织中 FSTL3 的蛋白和 mRNA 表达水平达到峰值(P0.05);缺血 2h,再灌注 2h 后,小鼠肺组织中 FSTL3 的蛋白和 mRNA 表达水平显著升高(P0.05),再灌注 4 h 后,FSTL3 的蛋白和 mRNA 表达水平均达到峰值(P0.05)。FSTL3-NA 处理可明显减轻脓毒血症小鼠肺病理损伤,下调肺组织 TNF-(1.230.11)和(2.450.27)和 MCP-1(0.340.02)和(2.230.04)的蛋白表达水平,上调 SOD1(3.050.16)和(1.870.32)和 SOD
4、2(2.450.19)和(1.610.24)的蛋白表达水平(均 P0.05)。FSTL3 基因敲除可明显减轻 IR 小鼠肺病理损伤,下调肺组织 TNF-(1.220.19)和(4.130.21)和 MCP-1(0.880.03)和(3.100.15)的蛋白表达水平,上调SOD1(2.270.16)和(0.410.06)和 SOD2(2.040.13)和(0.190.05)的蛋白表达水平(均 P0.05)。结论LPS 或IR 刺激后,小鼠血清及肺组织中的 FSTL3 明显升高,FSTL3 抑制或 FSTL3 基因敲除可明显减轻小鼠肺组织炎症和氧化应激。【关键词】卵泡抑素样蛋白 3;脓毒血症;缺血
5、再灌注;炎症;氧化应激【中图分类号】R592 【文献标志码】A 【DOI】10.11915/j.issn.1671-5403.2024.01.011收稿日期:2023-03-20;接受日期:2023-06-06基金项目:湖北省自然科学基金指导性计划(2022CFC021)通信作者:王博,E-mail:rmh_wb Expression of FSTL3 in acute lung injury in mice caused by different inducementsHuang Lidan1,Wang Bo2(1Department of Anesthesiology,2Departmen
6、t of Thoracic Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of human follistatin-like protein 3(FSTL3)in acute lung injury caused by different inducement in mice and its significance.Methods Mouse model of septic lung injury was estab
7、lished by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide(LPS),and the model of ischemia-reperfusion(IR)injury was established by clamping the left pulmonary hilum followed by opening.The protein expression level of FSTL3 in serum and the protein and mRNA expression level of FSTL3 in lung tissue wer
8、e detected at different time points of lung injury.FSTL3 neutralizing antibodies(FSTL3-NA)or FSTL3 gene knockout mice were employed to evaluate the effect of FSTL3 inhibition on lung injury in mice inflicted by 2 types of injuries.Western blotting was applied to detect the protein levels of tumor ne
9、crosis factor-(TNF-),monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1),superoxide dismutase(SOD)1 and SOD2 in the lung tissues.Statistical software GraphPad Prism 9.2 was used to analyze the data.One-way AVOVA was used to compare the measurement data between groups,and students t test was performed for inte
10、rgroup comparison.Results The serum protein level of FSTL3 was increased significantly in the mice at 12 h after intraperitoneal injection of LPS,reached a peak at 18 h,and then stabilized,both of which were significantly higher than 0 h(P0.05).After 2 h ischemia and 2 h reperfusion,the serum protei
11、n level of FSTL3 was elevated significantly,summited at 6 h of reperfusion,and the protein level after 8 h reperfusion was still notably higher than that at 0 h(P0.05).Western blotting and RT-PCR showed that the protein and mRNA levels of FSTL3 in the lung tissues reached the peaks after 18 h of LPS
12、 stimulation(P0.05);after 2 h of ischemia and 2 h of reperfusion,its protein and mRNA levels in lung tissue 95中华老年多器官疾病杂志 2024 年1 月28 日 第23 卷 第1 期 Chin J Mult Organ Dis Elderly,Vol.23,No.1,Jan 28,2024were increased significantly(P0.05),and reached the peaks after 4 h reperfusion(P0.05).FSTL3-NA trea
13、tment obviously alleviated the lung pathological injury in sepsis mice,and down-regulated the protein levels of TNF-(1.230.11)vs(2.450.27)and MCP-1(0.340.02)vs(2.230.04)in the lung tissue,while up-regulated the protein levels of SOD1(3.050.16)vs(1.870.32)and SOD2(2.450.19)vs(1.610.24)(all P0.05).FST
14、L3 gene knockout also obviously alleviated the lung pathological injury in IR injured mice,and down-regulated the protein levels of TNF-(1.220.19)vs(4.130.21)and MCP-1(0.880.03)vs(3.100.15)in the lung tissue and up-regulated those of SOD1(2.270.16)vs(0.410.06)and SOD2(2.040.13)vs(0.190.05)(all P0.05
15、).Conclusion After LPS or IR stimulation,FSTL3 level is significantly increased in both mouse lung tissue and serum,while its inhibition or knockout could significantly reduce inflammation and oxidative stress in murine lung tissue.【Key words】follistatin-like protein 3;sepsis;ischemia reperfusion;in
16、flammation;oxidative stressThis work was supported by the Project of Natural Science Foundation Guiding Plan of Hubei Province(2022CFC021).Corresponding author:Wang Bo,E-mail:rmh_wb 急性肺损伤是一种常见的危重症,病死率极高1。临床上,急性肺损伤患者主要表现为呼吸急促、紫绀、肺顺应性降低及肺水肿,病理特征主要以大量炎症细胞浸润,肺泡上皮和血管内皮屏障损伤为主2。根据病理进展,急性肺损伤被分为 4 个时期,包括早期渗出
17、期、晚期渗出或增殖期、扁平上皮化生期以及晚期增殖期3。引起急性肺损伤常见原因包括肺炎、肺栓塞以及肺移植后缺血再灌注或肺叶切除,间接原因为脓毒血症和创伤4。目前临床针对急性肺损伤的治疗除对症支持外,尚无特殊治疗及预防手段5。此外,不同病因所致的急性肺损伤,分子作用机制也有所差异。因此,进一步加深对不同病因所致急性肺损伤发病机制的认识,解析其发生发展过程中的关键靶点,对急性肺损伤的干预具有重要意义。人卵泡抑素样蛋白 3(follistatin-like protein 3,FSTL3)是Hayette 等6于1998 年在慢性淋巴细胞白血病患者 B 细胞中发现的一种新型分泌蛋白。近年来,越来越多的
18、研究发现 FSTL3 参与调节多种生物过程,包括细胞分化、衰老、炎症、氧化应激、代谢、免疫、动脉硬化和肿瘤进展7-9。有研究发现,FSTL3 可通过诱导脂质沉积和巨噬细胞炎症反应加速动脉粥样硬化发生发展10。此外,FSTL3 在超重或肥胖个体的脂肪组织中高表达,并与机体炎症反应呈正相关11。哮喘患者支气管上皮细胞中 FSTL3 的低表达水平与肺成纤维细胞的活力降低存在显著相关性12。上述研究均提示,FSTL3 在炎症疾病中发挥重要作用,但 FSTL3 在急性肺损伤中的表达及作用目前尚未有研究报道。本研究通过构建脓毒血症肺损伤及肺缺血 再 灌 注(ischemia reperfusion,IR)
19、损伤两种急性肺损伤模型,观察 FSTL3 在肺损伤发生发展过程中的表达,同时使用 FSTL3 中和抗体(follistatin-like protein 3-neutra-lizing antibody,FSTL3-NA)或 FSTL3 基因敲除小鼠评估 FSTL3 抑制对急性肺损伤的影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)纯度为 97.53%,购自上海源叶生物科技有限公司;肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、FSTL3、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant prote
20、in-1,MCP-1)、超氧化 物 歧 化 酶(superoxide dismutase,SOD)1、SOD2、甘 油 醛-3-磷 酸 脱 氢 酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),均 购 自 美 国Abcam 公 司;FSTL3 中 和 抗 体(follistatin-like 3-neutralizing antibody,FSTL3-NA),购自北京热景生物技术有限公司。1.2 实验小鼠及急性肺损伤模型的构建 SPF 级野生型(wild type,WT)雄性 C57 BL/6小鼠体质量 2024 g,周龄 810 周,购自于湖
21、北省实验动物研究中心。FSTL3 基因敲除雄性小鼠体质量 2024 g,周龄 810 周,购自于赛业生物科技有限公司。根据随机数表法,将 30 只 SPF 级 WT 雄性C57 BL/6 小鼠随机分为 5 组,依次为 LPS 注射 0 h组、6h 组、12h 组、18h 组和 24h 组,每组各 6 只,进行脓毒血症肺损伤造模。脓毒血症肺损伤模型具体构建过程:参考既往文献6报道的方式,小鼠腹腔单次注射 LPS 10 mg/kg,分别在 LPS 注射 0、6、12、18 及 24h 后,腹腔注射 50 mg/kg 的 2%戊巴比妥钠溶液对小鼠进行麻醉。随后,使用眼科剪逐层剪开小鼠胸部皮肤并剪断肋
22、骨,打开胸膜充分暴露肺及心脏。使用 1 ml 注射器,于心脏中抽取血液0.60.8 ml。同时留取小鼠左肺组织,将左上肺组织置于 10%中性福尔马林溶液,左下肺组织剪碎后置于冻存管中,放置于-80 冰箱。为进一步探讨FSTL3-NA 干预对脓毒血症肺损伤的作用,另选取18 只 SPF 级 WT 雄性 C57 BL/6 小鼠,根据随机数06中华老年多器官疾病杂志 2024 年1 月28 日 第23 卷 第1 期 Chin J Mult Organ Dis Elderly,Vol.23,No.1,Jan 28,2024表法,依次将其分为对照组、LPS 组及治疗组(LPS+FSTL3-NA 组),每
23、组各6 只。LPS 组及 LPS+FSTL3-NA组小鼠接受腹腔单次注射 LPS10 mg/kg。LPS+FSTL3-NA 组小鼠在 LPS 腹腔注射前 2 d 给予尾静脉注射 FSTL3-NA 80g/d,其余步骤同上。根据随机数表法,另将 30 只 SPF 级 WT 雄性C57 BL/6 小鼠随机分为 5 组,依 次 为 再 灌 注0h 组、2h 组、4h 组、6h 组、8h 组,每组各 6 只,进行肺 IR 造模。肺 IR 模型具体构建过程:参考既往文献7报道的方式,腹腔注射 50mg/kg 的 2%戊巴比妥钠溶液对小鼠进行麻醉。随后,将小鼠仰卧位固定于保温板上,左侧进胸后使用显微血管钳
24、夹闭左肺门 2h,松夹后分别再灌注 0、2、4、6 及 8 h。再灌注结束后使用 1ml 注射器,于心脏中抽取血液 0.60.8ml。同时留取小鼠左肺组织,将左上肺组织置于 10%中性福尔马林溶液,左下肺组织剪碎后置于冻存管中,放置于-80冰箱。根据随机数表法,另将 12 只 SPF 级 WT 雄性C57 BL/6 小鼠随机分为假手术(Sham)-WT 组 6 只和IR-WT 组6 只,将12 只FSTL3 基因敲除(FSTL3 KO)小鼠随机分为Sham-FSTL3 KO 组6 只和IR-FSTL3 KO 组6 只,进行肺 IR 造模,IR 组造模方法同上。1.3 小鼠血清中 FSTL3 及
25、 TNF-水平的检测 将各组小鼠全血样品在室温放置 2 h 后于 4下以 3 000 转/min 的速度进行离心 20 min,上清液即为 血 清 层。使 用 FSTL3 酶 联 免 疫 吸 附 检 测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(批号:CT66668,上海初态生物科技有限公司)和TNF-ELISA 试剂盒(批号:CT66709,上海初态生物科技有限公司)对各组血清样本中的 FSTL3 和TNF-含量进行检测,在 450 nm 波长下对各孔的吸光度进行读取并计算 FSTL3 和 TNF-的相对含量。1.4 免疫印迹 用于 4温度保存的
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