贝莱斯芽孢杆菌SM2对番茄灰霉病的生防效果.pdf
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1、DOI:10.16861/ki.zggc.202423.0487贝莱斯芽孢杆菌 SM2 对番茄灰霉病的生防效果张琦1,刘应敏2,杨东燕2,朱晓琴2,裴冬丽2,张庆琛2(1.河南师范大学生命科学学院河南新乡453007;2.河南省特色微生物资源开发与应用工程研究中心商丘师范学院生物与食品学院河南商丘476000)摘要:为探寻高效防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea)的优良菌株及其防治机制,从番茄根分离获得内生菌 SM2,经平板对峙法分析其对 B.cinerea 的抑菌特性,并通过生理生化特征和 16S rDNA 测序对其进行鉴定;采用盆栽法和田间试验测定 SM2 对番茄灰霉病的防效,
2、并测定防病组、致病组和对照组番茄叶片的生理生化指标等。结果表明,菌株 SM2 可引起 B.cinerea 菌丝发生畸变,抑菌率达 66.67%,被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);SM2 有效降低了番茄灰霉病的发病率和病情指数,盆栽、田间防效分别达到 71.73%、65.22%。与对照组相比,防病组和致病组番茄叶片的 SOD 活性、APX 活性、脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均显著升高,且防病组显著高于致病组。来自番茄的贝莱斯芽孢杆菌 SM2 是一株具有生防应用价值的菌株,通过显微拮抗作用和诱导番茄高表达保护酶活性与渗透调节物含量等途径有效防治番茄灰霉病。关键词:番茄
3、;灰霉病;贝莱斯芽孢杆菌;拮抗作用;诱导系统抗性;生物防治中图分类号:S641.2文献标志码:A文章编号:1673-2871(2024)02-066-08Biological control effects of Bacillus velezensis SM2 against Botrytis cine-rea causing tomato gray moldZHANG Qi1,LIU Yingmin2,YANG Dongyan2,ZHU Xiaoqin2,PEI Dongli2,ZHANG Qingchen2(1.College of Life Sciences,Henan Normal U
4、niversity,Xinxiang 453007,Henan,China;2.Henan Provincial Engineering ResearchCenter for Development and Appllication of Characteristic Microorganism Resources/College of Biology and Food,Shangqiu NormalUniversity,Shangqiu 476000,Henan,China)Abstract:The aim was to find an excellent strain for effici
5、ent biological control and biocontrol mechanism of tomatogray mold(Botrytis cinerea).Endophytic bacteria SM2 of tomato root was isolated and purified by plat marking.Theinhibitory effect of the strain SM2 on mycelial growth of B.cinerea was studied in dual cultures on PDAplates.Furthermore,the strai
6、n SM2 was identified according to physiology and biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing.Thebiocontrol effect of the strain SM2 against B.cinerea was determined by pot and field experiments,and the physio-bio-chemical characteristics of tomato leaves in biocontrol group,disease group and
7、 control were analyzed.The resultsshowed that strain SM2 was identified as Bacillus velezensis,which could cause mycelium distortion of B.cinerea,withinhibition rate of 66.67%.Pot and field investigation showed that B.velezensis SM2 effectively reduced the incidence anddisease index of B.cinerea,and
8、 the biocontrol efficiency reached 71.73%and 65.22%,respectively.Compared with thecontrol,SOD activity,APX activity,proline content and soluble protein content of tomato leaves in the biocontrol groupand disease group were significantly increased,and the increase rate of biocontrol group was signifi
9、cantly higher than thatof disease group.The above results demonstrate that B.velezensis SM2 is a valuable biocontrol strain,which can effectivelysuppress tomato gray mold through micro-antagonism and induce the increase of antioxidant enzymes activity and osmo-regulation substances content of tomato
10、.Key words:Tomato;Botrytis cinerea;Bacillus velezensis;Antagonism;Induce systemic resistance;Biological control收稿日期:2023-07-31;修回日期:2023-11-26基金项目:河南省科技攻关项目(232102110018,232102110164);河南省高校重点科研项目(23A210029);河南省高校科技创新团队(21IRTSTHN025)作者简介:张琦,女,在读硕士研究生,主要从事植物与微生物互作研究。E-mail:zhangqi_通信作者:张庆琛,男,副教授,主要从事植
11、物与微生物互作研究。E-mail:裴冬丽,女,教授,主要从事植物与病原菌互作研究。E-mail:中中 国国 瓜瓜 菜菜试验研究2024,37(2):66-7366第2期,等:贝莱斯芽孢杆菌SM2对番茄灰霉病的生防效果试验研究番茄(Solanum lycopersicum L.)富含维生素 C和番茄红素等多种营养物质,是栽培广泛、消费量大的蔬菜作物之一1。然而,在番茄的生长期和贮运过程中常发生番茄灰霉病,该病菌主要危害其叶片、果实等,严重威胁番茄的产量和品质,目前已成为番茄生产上最重要的病害之一2-3。番茄灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的一种世界性真菌病害4,目前农业
12、生产上因缺乏抗灰霉病番茄品种,防治方法主要为化学农药防治5。化学杀菌剂效果虽好,但容易导致环境污染、病原物耐药性增强、农药残留和生态破坏等问题6。生物防治具有安全、无残留、环保等优点,可以有效解决化学药剂产生的上述问题,因此已成为蔬菜绿色生产的研究热点。其中,芽孢杆菌(Bacillus)因具有抗逆性强、抑菌谱广、杀菌高效等优点,已被广泛用于番茄真菌病害的生物防治7。在盆栽试验中,高地芽孢杆菌(B.altitu-dinis)B1-15 在 6 叶期接种的番茄灰霉病防效显著7;枯草芽孢杆菌(B.subtilis)L1-21 对采后番茄果实灰霉病防效显著1;短小芽孢杆菌(B.pumilus)PTB1
13、80和 PTB185 利用其产生的脂肽类物质、抗菌活性可显著抑制番茄灰霉病8;摩加夫芽孢杆菌(B.moja-vensis)D50 发酵液处理番茄后,诱导了番茄果实的抗氧化酶活性和系统抗性相关基因(SlLoxD、SlMyc2等)高表达,灰霉病的发病率下降 33.50%9;贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)HY19 发酵液可显著提高盆栽番茄叶片抗氧化酶活性,降低番茄灰霉病发病率,防效为 73.12%76.51%10;B.velezensis X7 对盆栽番茄黄萎病的防效为 67.16%11;B.velezensis SH-1471发酵液对盆栽番茄枯萎病的防效为 93.80%12;蜡样芽孢杆
14、菌(B.cereus)EC9 通过茉莉酸/乙烯激活免疫保护番茄抗枯萎病13。上述研究表明,多种芽孢杆菌均能起到防治番茄真菌病害的效果,但生物防效有所不同,且研究多为盆栽生物防效。鉴于此,探索分离更多高效的芽孢杆菌,并利用其综合开展盆栽和田间防效及其生防机制的研究是非常必要的。笔者从番茄根内分离并鉴定内生菌 SM2,分析其发酵液对番茄灰霉病的盆栽和田间的防治效果,并从显微拮抗作用和诱导番茄系统抗性两个方面探讨生防机制,旨在为微生物菌剂的研发提供生防菌种和对番茄灰霉病生防应用提供理论支撑。1材料与方法1.1材料供试生防菌株 SM2 于 2022 年 5 月采自商丘师范学院番茄示范园区,从水塘边野生
15、健壮的番茄根内分离获得并鉴定;供试番茄灰霉病原菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea);供试番茄为 Moneymaker,于2023 年 5 月在商丘师范学院测定盆栽和田间病圃番茄的生防等相关指标参数。灰霉病菌 B.cinerea和番茄 Moneymaker 均由商丘师范学院植物与微生物互作重点实验室提供。1.2方法1.2.1番茄内生细菌 SM2 的分离、纯化与筛选参照张庆琛等11的方法,对水塘边野生健壮的番茄进行采样、消毒,取根并加入无菌水研磨至匀浆;将匀浆液稀释、涂布于溶菌肉汤(LB)固体培养基上,37 恒温培养箱培养 24 h;将单菌落划线纯化后,采用平板对峙培养法筛选对番茄灰霉
16、病菌 B.cine-rea 具有拮抗的内生细菌 SM2,并按照下列公式计算抑菌率,9 次重复。抑菌率/%=对照菌落半径-处理菌落半径对照菌落半径100。(1)1.2.2番茄内生细菌 SM2 的鉴定生理生化鉴定:参照赵诗佳等14的方法分析 SM2 菌株的革兰氏染色、淀粉水解、甲基红、过氧化氢酶、吲哚乙酸、明胶液化试验;参照东秀珠等15的方法测定 SM2 菌株的乙酰甲基甲醇试验(V-P test)、柠檬酸盐利用、乳糖、蔗糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、甘油、产铁载体等试验,并观察菌株形态特征。SM2菌株分子生物学鉴定:提取SM2基因组DNA,利用引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
17、-3)/1492R(5-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3)、796-F(5-GHCGBGGKATYCCDGTY-3)/796-R(5-TTYGTYTTBGTYTGNCC-3)16分别对 16S rD-NA、gyrB基因进行PCR扩增。PCR反应体系均为50 L:模板 DNA60 ng、上下游引物(10 molL-1)各 1 L、Buffer(Mg2+)0.5 L、dNTP 5 L、Taq 酶 0.5 L、ddH2O 补至 50 L。16S rDNA基因 PCR 反应条件:94 预变性 3 min;94 变性 30 s,55 退火 45 s,72 延伸 50 s,30 个循环;7
18、2 延伸 8 min。gyrB基因PCR反应条件:95预变性5min;94变性1min,55 退火 30 s,72 延伸 2 min,30 个循环;72 延伸 10 min。PCR 产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。利用 GenBank 数据库进行比对并下载与SM2菌株序列高度同源的16SrDNA和gyrB序列,采用 MEGA5.0 进行比对,去除两端不整齐的序列,使用 PhyloSuite 软件17中的 Concatenate Sequence 工具张琦,等:贝莱斯芽孢杆菌SM2对番茄灰霉病的生防效果67中国瓜菜第37卷试验研究拼接有效区间,再次导入MEGA5.0,基于Maximu
19、mLikelihood(ML)算法构建 16S rDNA 和 gyrB 联合系统进化树,以 Amphibacillus marinus J1 作为外类群。1.2.3SM2 菌株对番茄灰霉病的生物防效测定参照 Zheng 等9的方法制备 SM2 菌株发酵液。盆栽生物防效的测定:将盆栽番茄按照表 1 进行对照组、致病组、防病组处理,每个处理 3 次重复,每个重复 10 盆,每盆种植 1 株。田间生物防效的测定:将田间病圃番茄按照表 2 进行致病组、防病组处理;采用随机区组排列,每个处理 3 次重复,每个重复种植成 4 m2 m 的小区、双行种植、行距和株距均为 40 cm,每个重复随机选取 10
20、株待测。于番茄植株生长至 39 d,利用灰霉病菌 B.cinerea 孢子悬液(107CFUmL-1)对其叶片进行喷施处理,待处理至 15 d 调查番茄的发病情况。番茄灰霉病发病程度参照 Song 等7的分级标准,0 级:无症状;1 级:病叶面积占总叶片的 25%以下;2 级:病叶面积占总叶片的 25%50%;3 级:病叶面积占总叶片的50%75%;4 级:病叶面积占总叶片的 75%以上;计算发病率,并按照下列公式计算病情指数和防治效果。病情指数=各级病株数相应级别值调查总株数最高级别值;(2)防治效果/%=致病组病情指数-防病组病情指数致病组病情指数100。(3)表 1SM2 菌株对盆栽番茄
21、灰霉病进行生物防治的处理Table 1Treatment method of potted biological control of Botrytis cinerea by strain SM2处理Treatment对照组Control group致病组Diseased group防病组Biocontrol group浸种Soak seeds(8 h)无菌 LB 发酵液Sterile LB fermentation broth无菌 LB 发酵液Sterile LB fermentation brothSM2 发酵液SM2 fermentation broth(108CFUmL-1)植株长至
22、33 dPlants grow up to 33 d无菌 LB 发酵液Sterile LB fermentation broth无菌 LB 发酵液Sterile LB fermentation brothSM2 发酵液SM2 fermentation broth(108CFUmL-1)植株长至 39 dPlants grow up to 39 d喷施无菌水Sterile water喷施灰霉病菌Botrytis cinerea(107CFUmL-1)喷施灰霉病菌Botrytis cinerea(107CFUmL-1)表 2SM2 菌株对田间生长番茄灰霉病进行生物防治的处理Table 2Treat
23、ment method of field biological control of Botrytis cinerea by strain SM2处理Treatment致病组Diseased group防病组Biocontrol group拌种Seed dressing无菌 LB 发酵液Sterile LB fermentation brothSM2 发酵液SM2 fermentation broth(108CFUmL-1)植株长至 33 dPlants grow up to 33 d无菌 LB 发酵液Sterile LB fermentation brothSM2 发酵液SM2 fermen
24、tation broth(108CFUmL-1)植株长至 39 dPlants grow up to 39 d喷施灰霉病菌Botrytis cinerea(107CFUmL-1)喷施灰霉病菌Botrytis cinerea(107CFUmL-1)1.2.4SM2 菌株对番茄灰霉病的生防机制显微拮抗作用:在超净工作台上利用手术刀对 SM2 菌株与 灰 霉 病 菌 B.cinerea 对 峙 平 板 内 的 抑 菌 圈B.cinerea 边缘切出 1 cm0.5 cm 的小块,同时对等距位置的对照平板内的B.cinerea切出1cm长0.5cm宽的小块(作为对照),分别制作成临时装片,通过光学显微
25、镜(Leica DM2500)观察其灰霉病菌B.cinerea 菌丝生长状态,并拍照。诱导番茄系统抗性:利用 UV-2700 spectropho-tometer 按照表 1 接种灰霉病菌的第 0、7、15 天分别测定对照组、致病组和防病组盆栽番茄的下列生理生化指标,每个处理 3 次生物学重复。采用氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性18,采用Nakano 等19的方法测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,采用磺基水杨酸法测定脯氨酸含量20,采用考马斯亮蓝 G-250 结合法测定可溶性蛋白含量21。1.3数据处理采用 SPSS 21.0 软件基于 Fisher s LSD(最小
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