医学微生物与学实验指导.doc
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1、(word完整版)医学微生物与学实验指导医学微生物与免疫学实验指导主 编 韩 莉副主编 王嘉军 吴红艳编 者 (以姓氏笔画为序)王 磊 王嘉军 刘 英 吴红艳 杨建林 周永芹 张 颖 张丽红 宋银宏 邹黎黎 韩 莉 柳长柏三峡大学医学院生物病原部20012年5月29日前 言本教材由医学微生物学和医学免疫学两部分组成,通过实习课教学使学生了解和掌握医学微生物学、医学免疫学的基本实验技能操作和基本研究方法,同时也能获取相应的感性知识。为培养学生的思维能力和独立操作能力,在进行设计性实验课教学时,学生也能利用本实习指导作为工具,顺利地进行实验操作,以节省学生获取知识的时间。为此目的,对每项实验的目的
2、及实际意义都有所交代,对实验结果的观察与分析,也予以必要的辅导.限于教学时数和条件,有些内容将以示教、电视或电影教学方式教学,这部分尤其需要加强复习,以弥补未能亲自操作之不足。有关实验课的改革设想,仍须不断地接受实践考验,发扬成绩克服缺点,以不断地充实和提高。为了提高实验课效果,保证实验课质量,要求学生做到:1实验前必须做好预习,以了解实验的内容、目的、理论依据、操作方法及注意事项,避免或减少错误的发生.2实验过程中坚持严肃性,严格性与严密性,对操作的实验要在全面理解的基础上,按步骤依次进行操作,进行积极地思考;对示教内容要仔细观察并与有关理论密切联系. 3如实记录,分析结果,得出结论.如结果
3、与理论不符,应尽量分析,探讨起原因以培养训练自己的思维能力,最后写出实验报告。4实验报告中部分内容需要绘图,其具体要求如下:(1)必须在认真观察多个标本并基本掌握所观察标本的典型结构之后再绘图。(2)绘图要用规定的报告纸和铅笔画点线构成的轮廓图(部分绘图用彩色笔)。(3)绘图时要线条清晰,注字准确清楚,并应向右侧指线。(4)要妥善处理同一标本各部层次及同类标本间大小,比例关系.将放大倍数写于图下 编者2012年5月29日 内 容 简 介第一篇 医学微生物学医学微生物学实验是医学微生物学课程的重要组成部分,我们将医学微生物学实验课内容分为六个单元,改变以往单一的实验方式,在综合性实验的基础上开设
4、设计性实验,学生能比较系统地了解常用微生物学实验的原理、方法、结果分析、注意事项及用途,可以帮助学生理解和巩固所学的理论知识,培养学生的操作技能以及观察问题,分析、解决问题的能力、严谨的科学态度,同时实验与病案讨论结合,学生能将理论知识与临床实践有机联系,为学习其它基础医学,临床医学及预防医学奠定基础,从而提高学生的综合素质。第二篇 医学免疫学实践教学是课程建设的重要环节,培养和提高学生的综合素质与创新能力重要途径。在免疫学实验教学中我们大力改革实验教学的形式和内容,将免疫学的16学时实验内容分为两大部分,第一部分为综合性实验,包括了解天然免疫的组成与生物学功能的检测;常见体液免疫检测指标的设
5、计,使学生能较熟练应用基本的免疫学实验技术,能针对不同的临床病例开展相关免疫学项目的基本检测,并对检测结果进行合理的临床解释和分析.为了学生既能适应一般临床与科研工作,又具有一定的创新工作能力。第二部分我们开设设计性实验:市场有某一生物制剂有免疫增强作用,请设计实验方案证实。在这部分内容要求同学们初步掌握从不同角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计,掌握与了解常见细胞免疫的检测技术和应用(ELISA检测细胞因子)、免疫标记技术的种类、原理、特点、应用、淋巴细胞分离记数技术、淋巴细胞增殖等实验。目 录第一篇 医学微生物学实验室规则 6实验一 常见细菌形态学检查方法(综合性实验) 7实验二 细菌的
6、分离培养法与消毒灭菌(综合性实验) 15实验三 化脓性球菌的分离鉴定(设计性实验) 30实验四 肠道杆菌的分离鉴定(设计性实验) 34实验五 厌氧菌、分支杆菌的检查法(综合性实验) 43实验六 真菌及其它微生物检测(综合性实验) 49实验七 病毒学检查法(综合性实验) 49实验八 微生物学分子生物学技术微生物学各论自学提纲 59第二篇 医学免疫学实验一 天然免疫功能的检测(综合性实验)60实验二 常见抗原抗体反应(综合性实验)67实验三 细胞免疫检测I:细胞因子的检测(设计性实验)86实验四 细胞免疫检测II:淋巴细胞分离、计数及活性检测(设计性验)96实验五 细胞免疫检测III:淋巴细胞增殖
7、实验(设计性实验)105综合复习 104附录 115实 验 室 规 则由于实验对象主要是病原微生物,进入实验室必须严格遵守下列规则: 一、必须穿工作服(白大褂)才能进入实验室,除必要的书籍、文具外,其它杂物不得带入室内,离室时脱下的白大褂折叠好。 二、实验室内不准吸烟、饮食,不准口吸移液管或用嘴湿润铅笔、标签等.实验室要保持肃静和秩序,不得高声谈笑和随处走动。三、实验室中若不慎发生病菌污染桌面、衣物、伤口等意外,请报告指导教师进行适当处理,微生物学实验室意外的紧急处理办法:1皮肤破损:先除去异物,用生理盐水或蒸馏水洗净后,涂2 %红汞或2 碘酊。2烧伤:局部涂凡士林、5 %鞣酸或2 %苦味酸。
8、3化学药品腐蚀伤:强酸-先用大量清水冲洗,再用碳酸氢钠溶液洗涤中和。强碱-先用大量清水冲洗,再用5 %硼酸溶液洗涤中和.如受伤处为眼部,经上述步骤处理后,用橄榄油或液体石蜡12滴滴眼。4菌液误入口中:立即将菌液吐入消毒容器内,并用1:1000高锰酸钾液或3 双氧水漱口;根据菌种不同,服用抗菌药物预防感染。5菌液污染桌面:将适量2 3 %来苏或0。1 %新洁尔灭倾倒于污染处,浸泡30分钟后抹去。如手上沾有活菌,亦应浸泡于上述消毒液3分钟后,再用肥皂和清水洗净。 6火警:如发生火警时须沉着、冷静,切勿惊慌,应立即关闭电闸和煤气阀门。如为酒精、乙醚、汽油等有机溶液起火,切忌用水扑救,可用沙土等扑灭。
9、 四、请爱护、节约实验材料,若有损坏应报告教师,适当赔偿。 五、沾染过传染材料的吸管、滴管、玻片等不要乱放乱动,须按规定处理,未经许可室内物品不得携出室外.六、实验完毕,及时清理实验室,肥皂、清水洗手;值日生打扫室内卫生,关好水电、煤气、门窗、肥皂、清水洗手后离室。实验一、常见细菌形态学检查方法(综合性实验)【实验内容】一、细菌涂片制作及革兰氏染色法。二、细菌的基本形态与特殊结构观察。三、细菌动力的观察(悬滴法)。四、显微镜油镜的使用和维护。五、电镜观察细菌的菌毛。【目的要求】一、初步掌握细菌涂片制作过程及革兰染色的操作技术。二、认识细菌基本形态。三、了解细菌特殊结构及其与医学实践关系。四、初
10、步掌握油镜的使用和维护.五、了解电镜在医学微生物学研究中的应用。【实验原理】一、革兰染色法细菌染色法是细菌形态学检查的一项基本技术。由于细菌个体微小,无色半透明,在普通光学显微镜下不易清晰观察,一般需经染色来增加反差,从而有利于对细菌标本的观察。染料有带阴离子着色基团的酸性染料和带阳离子着色基团的碱性染料。在一般生理条件下(pH 7.4左右),细菌菌体都带负电荷,故用于细菌染色的染料多为带阳离子着色基团的苯胺染料,如美蓝、结晶紫、碱性复红等,它们较易与细菌菌体结合.染色方法可分单染色法和复染色法两大类。前者只用一种染料染色,只能观察细菌的形态和排列,不能显示细菌结构及染色反应性;后者是以两种以
11、上的染料染色,可显示出细菌的特殊结构或染色反应性能,在细菌的鉴别上有一定意义,其中最常用的为革兰染色法。细菌革兰(Gram)染色是最常用的细菌鉴别染色法,首先由Gram创用而得名.细菌染色后不仅可区别其形态和排列方式,还可根据染色结果将所有细菌分成革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类;不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌(G+菌),被酒精脱色后复染成红色者为革兰阴性菌(G-菌)。革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别,同时还为分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供了依据。革兰染色的原理目前存在三种假说:1通透性学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易透入;革兰阴性菌细胞壁结构疏松,肽聚糖
12、层薄,含大量脂质,乙醇易渗入。2等电点学说 革兰阳性菌等电点(pI 2 3)比革兰阴性菌(pI 4 5)低,在相同pH条件下,革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多,故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固,不易脱色。3化学学说 革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐,可与碘、结晶紫牢固结合,使已着色的细菌不被乙醇脱色;革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少,故易被脱色.在细菌标本染色前,必须将细菌固定在载玻片上,常用的固定方法为加热法,其目的是杀死细菌,且保持原有形态,并使细菌粘附在载玻片上,不致染色时脱落。二、细菌的基本形态和特殊结构观察1、油镜用油的原理 观察细菌形态,需要放大,过去的实验课观察标本时,多用低倍
13、镜、高倍镜放大。观察细菌标本时,必须用放大倍数更高的油镜才能清楚地看到细菌形态特点。因之微生物学实验主要使用油镜。 油镜的特点是前透镜很小,油镜头的标记也因厂牌不同而异,一般多刻有放大率。如(90,100),镜口率(N.A=l。25或1.30),Oil,国产镜头刻“油”字等。 油镜可以使标本放大10002500倍,研究细菌形态必须用油镜。油镜观察时,在标本与镜头之间必须滴加镜油,否则视野不清。原因是油镜前透镜很小,光线通过玻片标本后在空气中发生折射,进入镜头的光线少,致使视野暗物象不清。如在标本与镜头间加一滴(切勿散开)与玻片折光率(N=l。52)相近的香柏油(N=l。515)则进入镜头的光线
14、增多,视野明亮物象清晰(图2)滴油又能增加油镜孔径数值,提高显微镜的分辩率等。 玻片透镜香柏油图-2 油镜的原理 2、细菌的基本形态和特殊结构细菌的基本形态可分为球菌、杆菌和螺形菌三类。球菌按其分裂繁殖方向与分裂后排列情况又分为双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等;杆菌也有球杆菌、链杆菌、分枝杆菌、棒状杆菌等之分;螺形菌中菌体仅有一个弯曲,呈逗点状者叫弧菌,菌体有23个弯曲,且较僵硬者为螺菌。某些细菌除了有细胞壁、细胞膜、细胞浆和核质这些基本结构外,还具有其他特殊结构,包括荚膜、鞭毛、菌毛和芽孢。这些特殊结构有着各自的不同意义。三、细菌动力的观察(悬滴法)许多杆菌、弧菌具有鞭毛,有动
15、力,在液体中能从一个地方较快速地移动到另一个地方.一般球菌无鞭毛,没有动力,但受到所处环境中液体分子的冲击而仅呈位置变更不大的颤动。 四、电镜观察细菌的菌毛电子显微镜是根据电子光学原理,用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜,使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示.20世纪70年代,透射式电子显微镜的分辨率约为0。3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米)。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍,而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍,所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子。【实验材料与仪器】一、
16、无菌牙签、革兰染色液(结晶紫染液、碘液、95%酒精、复红染液)、生理盐水、载玻片、冲洗用具等二、普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸三、球菌、杆菌、螺形菌及特殊结构示教片四、葡萄球菌、变形杆菌幼龄(812小时)肉汤培养物、凹玻片、盖玻片、 凡士林等五、电镜H-7500,放大倍数2060万倍,最大分辨能力0。204 nm【实验方法与步骤】一、细菌涂片制作及革兰氏染色法 1制片: 涂片:取清洁玻片一张,在玻片的中央滴一小滴生理盐水(滴加生理盐水不宜过多)。用无菌牙签挑取牙垢少许,与玻片上的水滴混匀,涂布成一厘米大小的均匀薄膜. 干燥:将涂片放室温中自然干燥,切勿紧靠火焰烘烤,以免标本烤焦,损害菌
17、体结构。 固定:持玻片一端,标本面向上,迅速通过火焰三次(约23秒),以玻片温度达到皮肤能耐受的温度为宜。固定的目的是杀死细菌,使其固定于玻片上,并能增强细菌对染料的通透性。2革兰染色: 初染:将已固定的涂片标本,加结晶紫染液于涂面上染色1 min,然后水洗。 媒染:加革兰氏碘液媒染1 min,水洗。 脱色:滴加95%酒精,频频摇动载玻片,斜持载玻片,使脱下的染液流下,再次滴加酒精脱色,直至流下酒精无色或稍呈淡紫色为止,水洗. 复染:用稀释复红或沙黄染液复染30 s至1 min,水洗,自然干燥或吸水纸印干. 3观察结果: 用油镜观察染好后的标本片,记录所见结果,染成紫兰色者为革兰氏阳性菌,染成
18、红色者为革兰氏阴性菌。注意事项1玻片一定要清洁无油。2加生理盐水切莫贪多以免难于干燥,涂片要均匀且薄。3固定标本时切勿过热,以免菌体变形.4要掌握好染色时间,尤其是酒精脱色的时间,不宜过长或过短,以脱色至涂片为灰色为宜.5水洗时要以细流水徐缓冲洗,否则会将玻片上的标本冲掉.二、细菌的基本形态与特殊结构观察1方法(1)使用显微镜油镜、观察各种球菌、杆菌和螺形菌以及细菌特殊结构的示教片,比较各菌的形态、大小、排列和特殊结构特点。(2)绘图:将观察到的结果画在报告纸上并加以适当的描述。2结果(1)细菌基本形态的观察球菌:见排列方式不同的各种球菌,而且革兰染色性亦不同。杆菌:大肠杆菌为革兰阴性的短杆菌
19、;炭疽杆菌为革兰阳性杆菌,可见菌体粗大,两端平齐,酷似竹节状。弧菌:弧菌为革兰阴性菌,菌体略带弯曲,呈逗点状或括弧形,霍乱弧菌涂片染色可出现“鱼群状”的排列特点。(2)细菌特殊结构观察: 肺炎链球菌(荚膜):肺炎链球菌为革兰阳性菌,成双排列。在双球菌体外围有一层较厚的透明区域,即为荚膜。 变形杆菌(鞭毛):变形杆菌为革兰阴性菌,通过鞭毛染色,可见菌体周围有细长弯曲的数根丝状物,即为鞭毛。 破伤风梭菌(芽孢):破伤风梭菌为革兰阳性菌。经芽胞染色后,可见菌体顶端有一圆形,比菌体宽的结构,即为芽胞。芽胞与菌体相连形似鼓槌状,在细菌中为独有的形态。肉毒梭菌菌体次极端有一椭圆形、比菌体宽的芽胞,与菌体相
20、连,形似网球拍状。三、细菌的动力观察(悬滴法) 图3 细菌的动力观察(悬滴法)制片方法1取凹玻片两张、在凹窝周围涂抹少许凡士林。2各取一接种环的变形杆菌、葡萄球菌幼龄培养物,分别放于两块盖玻片中央。3将凹玻片反转。使凹窝对准盖玻片中心,覆于其上,粘住盖玻片后再反转。以接种环柄轻压盖玻片,使与凹窝边缘粘紧.4先以低倍镜找至悬滴的边缘后,再换用高倍镜观察(因凹玻片较厚,油镜焦距很短,故一般不能用油镜来检查).5观察时,注意比较变形杆菌和葡萄球菌的运动情况有何不同. 注意事项1观察悬滴标本时,先用低倍镜找到悬滴的边缘,然后将视野移至悬滴中央,将集光器下降,缩小光圈,使亮度减弱,再用高倍镜观察,否则亮
21、度太强,不好观察。2调节螺旋时,切忌过度下旋,以免压碎盖玻片。3用接种环在试管中取材的方法(如图4):(1)左手拇指、食、中三指持试管底,右手拇、食、中三指握笔式持接种环,并垂直于火焰上烧灼至发红为止。移至火焰旁待冷。 (2)在火焰附近用右小指夹取试管上的棉塞,移动后轻轻拔出,并持于小指与小鱼际之间,不得将棉塞放置桌上或触及任何物品。 (3)将试管口移至火焰上旋转烧灼,灭菌后移至火焰附近,用冷却后的接种环插入试管内取少许生理盐水(若为液体则沾取一环菌液后退出),接种环不可与试管壁接触,以免环上生理盐水碰落。取出后立即将管口在火焰上转动灭菌后塞上棉塞。接种环使用后经烧灼灭菌插入试管架上。图4 接
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