农杆菌介导的植物转基因技术实验指导.doc
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1、。 农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理;掌握农杆菌介导转化植物的实验方法,了解转基因技术的操作流程。二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。实
2、验一 培养基配制一、仪器和试剂1、仪器:高压灭菌锅,超净工作台2、药品:Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ,Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ,Peptone (蛋白胨) 5g/L ,Sucrose (蔗糖) 5g/L ,MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ,Agar (琼脂) 1.5g/100ml, MS粉,有机溶液,肌醇,Fe盐,NAA(萘乙酸),6-BA(6-苄氨基腺嘌呤),卡那霉素(kan),利福平(rif),链霉素(str)。二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基:先称取1.25g Beef extract
3、 (牛肉浸膏);1.25g Peptone (蛋白胨);0.25g Yeast extract (酵母提取物);1.25g Sucrose (蔗糖);1g MgSO4.7H2O;琼脂粉3.75g;将上述药品置于250ml三角瓶中,用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀,然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。2、灭菌:将盛有250ml培养基的三角瓶封口,在三角瓶表面写清培养基名称,用高压灭菌锅进行灭菌。3、抗生素的加入:高压灭菌后,待培养基温度降到50-60时(手可触摸)加入已经过滤好的抗生素(100g/mlkan+50g/ml Str+50g/ml rif),以免温度过高导致抗生素
4、失效。 4、倒板:将抗生素与培养基混匀,每个平皿倒15ml培养基,可以倒16个平皿,倒完后打开平皿盖,在紫外灯下照10min,等待培养基凝固,盖上平皿盖,封口备用。第二组配制YEB液体培养基1、配制500mlYEB液体培养基:先称取2.5g Beef extract (牛肉浸膏); 2.5g Peptone (蛋白胨);0.5g Yeast extract (酵母提取物); 2.5g Sucrose (蔗糖);2g MgSO4.7H2O;将上述药品置于500ml三角瓶中,用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀,然后再定容至500ml,用NaOH调pH=7.4。2、灭菌:将盛有500ml培养基的
5、三角瓶封口,在三角瓶表面写清培养基名称,用高压灭菌锅进行灭菌。3、抗生素的加入:高压灭菌后,待培养基温度降到50-60时(手可触摸)加入已经过滤好的抗生素(100g/mlkan+50g/ml Str+50g/ml rif),以免温度过高导致抗生素失效。 4、分装:将培养基分别分装到试管和三角瓶中,每个试管中分装5ml,分装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml,共12个三角瓶。5、分装好后,封口备用。第三组配制MS液体培养基1、配制500mlMS液体培养基:先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水,称取2.15gMS粉置于蒸馏水中,搅拌均匀;再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液;5ml10
6、0倍肌醇浓缩液;5ml有机溶液的混合液,然后混匀定容至500ml,用NaOH调pH=5.8。2、灭菌:将盛有500ml培养基的三角瓶封口,在三角瓶表面写清培养基名称,用高压灭菌锅进行灭菌。3、乙酰丁香酮的加入:高压灭菌后,待培养基温度降到50-60时(手可触摸)加入已经过滤好的乙酰丁香酮。 4、分装:将培养基分别分装到三角瓶中,每个三角瓶中倒入40ml,共12个三角瓶。5、分装好后,封口备用。第四组配制MS共培养基1、配制500mlMS固体共培养基:先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水,称取2.15gMS粉置于蒸馏水中,搅拌均匀;再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液;5ml100倍肌
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