鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45,No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212022鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用郭鹏宇,赵妍*,刘胜旺*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室 禽呼吸道传染病创新团队,黑龙江 哈尔滨150069)摘要:鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。为建立检测该病毒gG蛋白的间接竞争EL
2、ISA方法,本研究以原核系统表达ILTV gG蛋白,并采用切胶纯化该重组gG蛋白(rgG)后经western blot检测纯化的rgG(P-rgG)与本研究室制备的gG蛋白单克隆抗体(MAb)3C8的反应原性。将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8),利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价。结果显示,P-rgG与MAb 3C8发生了特异性反应,在30 ku处出现特异性条带。纯化的HRP-3C8效价达1颐51 200。以P-rgG作为包被抗原,以纯化的HRP-3C8作为检测抗体,通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV gG蛋白间接竞争ELI
3、SA(ic-ELISA)检测方法。条件优化结果显示,P-rgG包被量为12.5 ng/孔,HRP-3C8抗体稀释度为1颐10 000,将待检样品与HRP-3C8抗体在37孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应10 min。将待检样品的抑制率(PI)逸31.08%判为阳性;采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV),通过计算PI,评估该方法的特异性;按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID50),再将该病毒2倍倍比稀释(1颐101颐2 560)后,以该ic-ELISA方法检测
4、,评估该方法的敏感性;利用同批次和不同批次P-rgG分别包被ELISA板,采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除了能检测ILTV外,其余相关病毒均为阴性结果;将ILTV稀释至1颐320时检测结果仍为阳性,相当于75 EID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%。利用该方法及荧光定量PCR(qPCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗,该方法检测结果显示,阳性检测率为73.3%(44/60),阴性率为26.7%(16/60)。qPCR的检测结果显示,阳性检测率为8
5、1.7%(49/60),阴性率为18.3%(11/60),二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%,总符合率为88.3%。本研究建立的ILTV gG蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品,为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段。关键词:鸡传染性喉气管炎病毒;gG蛋白;单克隆抗体;间接竞争ELISA中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)07-0704-06Establishment and preliminary application of an indirectcompetit
6、ive ELISA for detecting the gG protein of infectiouslaryngotracheitis virusGUO Peng-yu,ZHAO Yan*,LIU Sheng-wang*(State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Avian Respiratory Diseases Division,收稿日期:2022-12-20基金项目:黑龙江省自然科学基金(团队项目)(TD2021C001);现代农业产业技术体系岗位科学家专(CARS-40-K18)作者简介:郭鹏宇(1
7、998-),女,黑龙江哈尔滨人,硕士研究生,主要从事禽呼吸道病诊断方法的研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding authorHarbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract:Infectious laryngotracheitis is an acute and highly contagious respiratory disease caused by infectiouslaryngotracheiti
8、s virus(ILTV).In order to establish an indirect competitive ELISA(ic-ELISA)method for the detection of gGprotein of the virus,ILTV gG protein was expressed in prokaryotic system,and the recombinant gG protein(rgG)was purified(P-rgG)by gel slices,and the reactivity of P-rgG with monoclonal antibody(M
9、Ab)3C8 of gG protein prepared in our laboratorywas detected by western blot.MAb 3C8 was purified by Protein G affinity chromatography and coupled with HRP(HRP-3C8).The titer of the purified HRP-3C8 was determined by indirect ELISA.The results showed that P-rgG reacted specifically with MAb3C8,and sp
10、ecific bands appeared at 30ku.The titer of purified HRP-3C8 was 1颐51200.The P-rgG and purified HRP-3C8 wereused as the coated antigen and the detection antibody,respectively.An ic-ELISA method for ILTV gG protein was established byoptimizing the reaction conditions.The results showed that the coated
11、 amount of P-rgG was 12.5ng/well and the dilution ofHRP-3C8 antibody was 1颐10000.The samples to be tested were incubated with HRP-3C8 antibody at 37for 40min and thenadded to ELISA plate for 20min,and the reaction time of TMB substrate was 10min.The inhibition rate(PI)逸31.08%of testedsamples was con
12、sidered as positive.The method was used to detect ILTV,Newcastle disease virus,infectious bronchitis virus(IBV)and fowlpox virus(FPV),and the specificity of the method was evaluated by calculating the inhibition rate PI.The 50%egginfectious dose(EID50)of ILTV K317 strain was measured by Reed-Muench
13、method,and then the virus was diluted by a 2伊ratio(1颐10-1颐2560),and then detected by ic-ELISA method to evaluate the sensitivity of the method.The P-rgG from the same batchand different batches were coated with ELISA plates respectively,and the positive and negative ILTV samples were detected bythe
14、ic-ELISA method to evaluate the repeatability of the method.The results showed that the other related viruses were negativeresults except ILTV.When ILTV was diluted to 1颐320,the detection result was still positive,equivalent to 75 EID50/0.1mL.Thecoefficient of variation for both intra-batch and inte
15、r-batch repeats tests was less than 10%.The method and fluorescencequantitative PCR(qPCR)were used to detect 50 sample of oropharyngeal swabs and laryngeal tissues of clinically infectedchickens with ILTV,IBV and FPV,and 10 ILTV vaccines,respectively.The ic-ELISA method showed that the positive rate
16、 was73.3%(44/60)and the negative rate was 26.7%(16/60).The results of qPCR showed that the positive detection rate was 81.7%(49/60)and the negative rate was 18.3%(11/60).The positive and negative coincidence rates of the two methods were 90.9%and87.8%,respectively,and the total coincidence rate was
17、88.3%.The ic-ELISA method established in this study has strongspecificity,high sensitivity and good repeatability,which provides a new technical means for detection of various clinical samplesof ILTV-infected chickens and ILTV vaccine in the laboratory.Key words:infectious laryngotracheitis virus;gG
18、 protein;monoclonal antibody;ic-ELISA鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病1。该病剖检病变主要为气管黏膜肿胀、糜烂和出血,严重时可导致死亡2。ILTV具有典型的疱疹病毒形态学特征,糖蛋白G(Glycoprotein G,gG)是ILTV的主要囊膜糖蛋白之一,其在琢疱疹病毒中编码的基因序列相对保守3,参与病毒的有效增殖及细胞间扩散等多种生物学过程4。在ILTV感染后2 d即可在气管中检测到gG蛋白,早于机体出现临床症状的时间5。因此,g
19、G蛋白可用于病毒感染早期的检测5。目前,ILTV的检测方法有病毒分离、中和试验、PCR、荧光定量PCR、ELISA6以及琼脂扩散试验7等。其中,荧光定量PCR方法可以在2 h内完成检测,是一种非常快速的检测方法8,但对仪器设备要求较高,现地应用受限。而ELISA方法快速、敏感,操作简便,更适用于临床应用9。但ILTV的间接竞争ELISA(ic-ELISA)方法目前尚未见报道。因此,本研究利用纯化的ILTV gG蛋白作为竞争抗原,以特异性识别gG蛋白的单克隆抗体(MAb)为检测抗体,并通过各反应条件的优化初步建立ic-ELISA方法,为ILTV的检测提供新的技术支持。1材料与方法1.1主要实验材
20、料及实验动物ILTV活疫苗K317郭鹏宇,等.鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用第7期705株、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)、鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)、48份ILTV阴性样品(包括鸡胚尿囊液,口咽拭子和喉头组织)、50份来自ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、gG蛋白MAb 3C8杂交瘤细胞株、大肠杆菌Rosetta感受态细胞、表达质粒pET-30a-gG均由本实验室保存;10份ILTV活疫苗分别购自
21、哈尔滨维科生物技术有限公司和哈药集团生物疫苗有限公司。SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽类实验动物资源库提供。SPF级8周龄BALB/c雌性小鼠购自辽宁长生实验动物中心。动物实验由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所伦理审查委员会批准(HVRI-IACUC-2020-213),并按照相关动物试验规程和动物伦理指南进行。1.2主要试剂RPMI 1640培养基购自Gibco公司;Fetal Bovine Serum/胎 牛 血 清 购 自HyClone公 司;PageRuler预染蛋白Marker、Triton X-100购自ThermoFisher公司;SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5
22、伊)、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Protein G亲和层析介质购自金斯瑞生物科技股份有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)偶联试剂盒-Lightning-LinkR购自Abcam公司;酶标板稳定剂I购自湖州英创生物科技有限公司;KPL SureBlue TMB显色底物、KPL TMB终止液、DyLightTM800标记的鼠源lgG(H+L)荧光抗体购自Seracare Life SciencesInc公司;IPTG、弗氏完全佐剂、牛血清白蛋白(BSA)、吐温20购自Sigma公司。1.3重组gG蛋白(rgG)的诱导表达、纯化与鉴定 将重组质粒pET-30a-gG转化大
23、肠杆菌Rosetta感受态细胞,372.5 h后加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG诱导表达,4 h后10 000 g离心5 min收集菌体,超声破碎后,将上清和包涵体分别经SDS-PAGE分离后,以0.25 mol/L KCl溶液浸泡,切下含目的蛋白的胶条加PBS(0.1 mol/L pH7.4)冻融碾碎,吸出蛋白溶液,用10 ku MWCO超滤管过滤后将缓冲液换成PBS,即为纯化的rgG(P-rgG)。利用BCA法测定P-rgG的浓度。以MAb 3C8腹水(1颐1 000)为一抗,以DyLightTM800标记的鼠源lgG(H+L)荧光抗体(1颐10 000)为二抗,采用western
24、 blot检测P-rgG与MAb 3C8的反应原性。1.4gG蛋白MAb 3C8小鼠腹水 的制 备、纯化、HRP标记与效价测定将MAb 3C8的杂交瘤细胞以含10%FBS的RPMI 1640培养至对数生长期,以2伊105个/只注射到用弗氏完全佐剂(0.5 mL/只)致敏7 d的BALB/c小鼠腹腔中。待小鼠腹部膨胀后无菌采集腹水。采用Protein G亲和层析柱纯化小鼠腹水10-11,并采用SDS-PAGE检测。将纯化的MAb 3C8(0.1 mg)按照HRP偶联试剂盒说明书标记后命名为HRP-3C8。以P-rgG包被ELISA板,利用间接ELISA法分别测定2倍倍比稀释(1颐1001颐102
25、 400)的纯化的MAb 3C8和HRP-3C8的抗体效价。1.5ic-ELISA检测方法的建立及反应条件的优化按照如下方式优化该ic-ELISA方法的各反应条件:分别以碳酸盐缓冲 液(CBS)(0.05 mol/L pH9.6)、Tris-HCl缓 冲 液(0.05 mol/L pH8.6)和PBS为包被液;将P-rgG分别以100 ng/孔、50 ng/孔、25 ng/孔、12.5 ng/孔和6.25 ng/孔4包被过夜;以5%脱脂乳、1%BSA和酶标板稳定剂I为封闭液,37作用2 h;以1%Triton X-100和PBS为样品稀释液;将HRP-3C8检测抗体分别稀释1颐5 000、1颐
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