海南西沙试验站大气霉菌群落初步调查.pdf
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1、第 21 卷 第 3 期 装 备 环 境 工 程 2024 年 3 月 EQUIPMENT ENVIRONMENTAL ENGINEERING 121 收稿日期:2023-10-11;修订日期:2024-01-10 Received:2023-10-11;Revised:2024-01-10 基金项目:国防技术基础科研项目(JSHS2019610B001-2)Fund:Basic Research Project of National Defense Technology(JSHS2019610B001-2)引文格式:戈帆,肖建军,刘剑,等.海南西沙试验站大气霉菌群落初步调查J.装备环境工程
2、,2024,21(3):121-128.GE Fan,XIAO Jianjun,LIU Jian,et al.Preliminary Investigation of Atmospheric Fungal Community in Xisha Experimental StationJ.Equip-ment Environmental Engineering,2024,21(3):121-128.海南西沙试验站大气霉菌群落初步调查 戈帆1,2,3,肖建军1,2,3,刘剑1,2,3,杨玉萍1,2,3,王冲文1,2,3,刘艳芳1,2,3,赵远荣1,2,3,杨品杰1,2,3,刘云红1,2,3,李叶涵
3、1,2,3(1.云南北方光电仪器有限公司,昆明 650114;2.云南西双版纳大气环境材料腐蚀国家野外科学观测研究站,昆明 650114;3.西双版纳大气环境材料腐蚀云南省野外科学观测研究站,昆明 650114)摘要:目的目的 筛选西沙试验站大气环境优势菌种,进行西沙试验站装备敏感菌研究。方法方法 采用撞击法进行大气霉菌采样,用统计学法计算出不同试验场地真菌数量,结合形态学法与 ITS1-5.8S-TIS2 或 26S rDNA D1/D2 区序列分析法鉴定菌种,并用 SPSS 初步探讨大气真菌与环境因素的关系,分析西沙试验站装备敏感菌。结果结果 西沙试验站优势种为 Aspergillus a
4、culeatus、Penicillium citrinum、Pithomyces sacchar、变红镰孢霉Fusarium incarnatum、Cladosporium oxysporum 和 Cladosporium oryzae,影响西沙试验站大气霉菌群落结构的重要环境因素是相对湿度和风速,贮存在西沙试验站的装备容易长霉,多种材料有不同的敏感菌,尤其是涂层样件和橡胶类材料。结论结论 西沙试验站大气环境中存在种类繁多的霉菌。关键词:西沙试验站;大气霉菌;优势种群;环境因素;装备;敏感菌 中图分类号:TJ06 文献标志码:A 文章编号:1672-9242(2024)03-0121-08 D
5、OI:10.7643/issn.1672-9242.2024.03.016 Preliminary Investigation of Atmospheric Fungal Community in Xisha Experimental Station GE Fan1,2,3,XIAO Jianjun1,2,3,LIU Jian1,2,3,YANG Yuping1,2,3,WANG Chongwen1,2,3,LIU Yanfang1,2,3,ZHAO Yuanrong1,2,3,YANG Pinjie1,2,3,LIU Yunhong1,2,3,LI Yehan1,2,3(1.Yunnan N
6、orth Optical&Electronic Instrument Co.,Ltd.,Kunming 650114,China;2.Yunnan Xishuangbanna National Observation and Research Station for Materials Corrosion in Atmospheric Environment,Kunming 650114,China;3.Yunnan Xishuangbanna Observation and Research Station for Materials Corrosion in Atmospheric Env
7、ironment,Kunming 650114,China)ABSTRACT:The work aims to screen dominant fungal species in the atmospheric environment of Xisha Experimental Station and conduct research on sensitive fungal in Xisha Experimental Station equipment.The impact method was used for sampling atmospheric fungi,and statistic
8、al methods were used to calculate the number of fungi in different experimental sites.Morpho-logical methods were used,the species were identified in combination with ITS1-5.8S-TIS2 or 26S rDNA D1/D2 region se-quence analysis.SPSS was used to preliminarily explore the relationship between atmospheri
9、c fungi and environmental factors,and to analyze the sensitive fungi in Xisha Experimental Station equipment.The dominant species at the Xisha Experimental 环境试验与观测 122 装 备 环 境 工 程 2024 年 3 月 Station were Aspergillus aculatus,Penicillium citrinum,Pithomyces sacchar,Fusarium incarnatum,Cladosporium ox
10、ysporum,and Cladosporium oryzae.The important environmental factors affecting the structure of the atmospheric mold community at Xisha Experimental Station were relative humidity and wind speed.Equipment stored in Xisha Experimental Station was prone to mold growth,and various materials had differen
11、t sensitive fungi,especially for coating samples and rubber materials.There are various types of fungi in the atmospheric environment of Xisha Experimental Station.KEY WORDS:Xisha Experimental Station;atmospheric fungi;dominant populations;environmental factors;equipment,sen-sitive fungi 霉菌是一类较低等而又比
12、较特殊的异养真核生物1,它通过吸附在有机物质上进行渗透营养生长,霉菌个体较小,结构较单一,生命力旺盛,分布在地球的任何一个角落,霉菌在生态系统中是极为重要的生命体之一2-3。根据现有的文献得知,世界上霉菌的种类大约有 150 万种,仅有 5%的霉菌被描述和发现,它分布广泛,种类繁多,它在生态系统的物质循环和能量流动过程中发挥了重要作用1。大气霉菌主要来源于植物、动物、土壤等2,同时也存在人为因素,如食品加工、药物制剂和农业生产等都能传播霉菌孢子3。西沙试验站所在地区由于其独特的气候条件,大气中富含细菌、真菌等海洋微生物4-6。部署在该区域内的舰船、飞机以及电子设备等装备,其涂层防护体系容易被海
13、洋微生物附着,从而引发涂层的微生物腐蚀现象7-9。霉菌能以材料表面的防护涂层为碳源,在表面生长繁殖,其代谢产生的有机酸等可直接破坏涂层,继而腐蚀基体材料10-12。霉菌对涂层和材料的腐蚀效果取决于腐蚀过程,而腐蚀过程是霉菌生长繁殖、新陈代谢、生物膜形成、金属材料表面电化学变化等一系列过程的综合结果13-14。西沙试验站具有典型的高温高湿海洋环境特点,霉菌易生长繁殖,暴露在霉菌生长环境中的典型防护涂层体系装备不可避免地会受到霉菌的腐蚀。因此,大气霉菌组成和多样性的可靠性检测是开展西沙试验站大气环境霉菌防护的基础3。本研究通过对西沙试验站的大气霉菌进行研究,了解大气霉菌数量和优势种群,初步探讨大气
14、霉菌与环境因素的关系。开展西沙试验站自然环境防霉技术研究,为典型防护涂层体系装备制定适宜的霉菌试验方法和防霉措施提供数据支撑。1 试验 1.1 具体步骤 霉菌采集步骤和方法如图 1 所示。大气霉菌采集方法15参考 GB/T 18204.32013 公共场所卫生检验方法第 3 部分:空气微生物(见附件 A),菌种鉴定以传统的鉴定方法为主,辅助 ITS1-5.8S-ITS2 或 26S rDNA D1/D2 区序列分析。在 2021 年 3 月 10 日、2022 年 7 月 9 日对西沙试验站进行了 2 次大气霉菌样品采集,以西沙试验站 图 1 霉菌鉴定步骤和方法 Fig.1 Steps and
15、 methods for fungi identification 第 21 卷 第 3 期 戈帆,等:海南西沙试验站大气霉菌群落初步调查 123 的试验场(完全暴露的自然环境)、试验棚(半封闭暴露的自然环境)、试验库(全封闭暴露的自然环境)为霉菌采集地,使用撞击法进行采集。按 GB/T 18204.32013 中撞击法对布点的要求,在试验场布5 个采样点,试验棚和试验库各布 1 个采样点,采样点分布如图 2 和图 3 所示。采样时间是 13 点,用撞击法16-18将样品采集到沙氏培养基上,每个采样点 3个平行样。采样器采用六级筛孔微生物撞击器,采样高度为 1.5 m。西沙试验站第一次采样时间
16、为 1、2、5、10 min,第二次采样时间为 1 min。采样大气流量均为 28.3 L/min。将沙氏培养基放入 28 培养箱中培养,分别在第 3、5、7 d 进行菌落计数和霉菌挑取,用 PDA 培养基进行霉菌纯化。计数过程中,将每个单一菌落转接到 PDA 试管上,放入霉菌培养箱中在28 下培养 7 d,观察菌株的形貌特征,合并同类菌,合并后菌株数多的即为该采样地优势菌种。用灭菌的棉签直接蘸取材料或者产品表面生长的霉菌菌落,将蘸取霉菌的一端朝下,放入 PDA 斜面培养基上,在实验室用涂皿的方式进行分离纯化菌株。图 2 试验场采样点示意图 Fig.2 Schematic diagram of
17、 sampling points in the testing ground 图 3 试验棚、库采样点示意图 Fig.3 Schematic diagram of sampling points in the testing shed and warehouse 霉菌传统的鉴定主要以菌落形态和显微形态为主19-24。菌落形态采用 3 种培养基(CYA、PDA、MEA)进行点植培养,观察 4、7、11 d 菌落的生长速度,形态、质地、颜色等;显微形态主要采用 PDA和促孢培养基进行插片培养,分别于 4、7、15、30、45、60 d 进行抽片观察菌丝的颜色、粗细、有无隔膜和锁状联合等,以及孢子、
18、孢子器、孢子盘、孢子座、胞囊、担子、担孢子的颜色、大小、形态、着生方式等,并对其大小进行测量。运用改良的 CTAB 法25对霉菌基因组 DNA 进行提取,DNA 的 ITS 基因序列PCR 扩增反应体系(25 L):Mix 为 12.5 L,引物ITS1、ITS4(或 NL1、NL4)和 DNA 模板各为 1 L,水为 9.5 L。PCR 扩增条件:94 预变性 5 min,94 变性 1 min,56 退火 45 s,72 延伸 1 min,35 个循环,72 延伸 10 min。电泳为 25 min,120 V,1%的琼脂糖凝胶。将扩增好的 PCR 产物送上海生工生物有限公司进行序列测定。
19、ITS1-5.8S-ITS2 或 26S rDNA D1/D2 区测序结果采用 DNAstar 软件进行人工校正,然后在 NCBI 的 GenBank 核酸序列数据试验库中搜索同源序列,采用 Clustal 和 MEGA 软件进行分子系统学分析。之后查阅霉菌鉴定手册 半知菌属 图 解 霉 菌 分 类 学 霉 菌 的 形 态 和 分 类 Dictionary of the Fungi:10th Edition等霉菌鉴定工具书,结合形态学和 ITS1-5.8S-TIS2 或 26S rDNA D1/D2 的结果进行鉴定到种,对霉菌种类、特性进行分析,确定优势菌种的生物学分类地位。对比 5 个周期优
20、势菌种鉴定结果,确定出采样地数量多、分布广、生存周期长的优势菌种。1.2 数据处理 每个采样点的 3 个平行样用格鲁布斯检验法进行检验,按式(1)求出 Gi。再置信区间 99%,临界值 G99(3)=1.15。若 Gi1.15,则判定为离群值,应舍去;若 Gi1.15,则判定为正常值,再用正常值求出平行样霉菌菌落数的平均值,即为该采样点平板菌落总数。数据的修约按照 GB/T 81702008数据修约规则与极限数值的表示和判定执行。Gi=|Xi-X|/S (1)式中:Xi为可疑值;X 为样本平均值;S 为标准差。用撞击法采样的平板计数结果,按式(2)计算出各采样点每立方米大气霉菌菌落数。空气中霉
21、菌菌落数=(N1 000)/(28.3t)(2)式中:N 为经培养后平板上生长的菌落数;T 为平板暴露时间,min。2 结果与讨论 2.1 大气环境霉菌数量分析 由表 1 知,不同的采样时间得到的霉菌数量不同,总体上 1 min 采集到的霉菌数量最多,10 min 的最少。按场地来说,试验场的霉菌数量最多,约为2 7006 000 cfu/m3,其次是试验库,约为 2 100 cfu/m3,最少是试验棚,约为 1 200 cfu/m3。通过试验可知,西沙试验站环境大气霉菌最佳采集时间为 1 min。由表 2 知,第二次在西沙试验站采样得到的霉菌数量比 124 装 备 环 境 工 程 2024
22、年 3 月 表 1 2021 年西沙试验站大气环境霉菌菌落计数结果 Tab.1 Results of fungal colony count in the atmospheric environment of Xisha Experimental Station in 2021 1 min 2 min 5 min 10 min 场地 计数 结果 菌落数/(cfum3)计数 结果 菌落数/(cfum3)计数结果菌落数/(cfum3)计数 结果 菌落数/(cfum3)试验场 1 127 4 488 192 3 392 118834 205 724 试验场 2 172 6 078 216 3 816
23、 2491 760 388 1 371 试验场 3 222 7 845 192 3 392 3402403 350 1 250 试验场 4 76 2 686 275 4 859 129912 125 442 试验场 5 405 14 311 309 5 459 3732 636 328 1 159 试验棚 39 1 378 65 1 148 1531 081 152 537 试验库 62 2 191 100 1 767 1941 371 172 608 表 2 2022 年西沙试验站大气环境霉菌菌落计数结果 Tab.2 Results of fungal colony count in the
24、 atmospheric environment of Xisha Experimental Station in 2022 结果 试验场 1 试验场 2 试验场 3 试验场 4 试验场 5 试验棚 试验库 计数结果 34 29 32 29 78 27 89 菌落数/(cfum3)1 201 1 025 1 131 1 025 2 756 954 3 145 第一次少很多,可能因为采样前几天持续降水,导致空气中的霉菌孢子浓度降低,试验库的数量最多,试验棚最少。2.2 西沙试验站大气霉菌群落结构 2021 年从试验场、试验棚、试验库的 3 个平行样中挑取并纯化了 1 585 株菌种,进行插片、点
25、植和结合分子生物学方法,共鉴定为 5 属 17 个种,结果 见表 3。西沙试验站中大气霉菌数量较多的是Aspergillus aculeatus、Cladosporium oryzae和 Cladosporium oxysporum,分别有 402、336、283 株,占总菌株数的 25.36%、21.20%、17.85%。试验场分离得到 13 种霉菌,数量较多的是 Aspergillus acu-leatus、Cladosporium oryzae 和 Cladosporium ox-ysporum,分别有 334、309、214 株,占试验场菌株数(1 286)的 25.80%、24.02
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