Chapter-7-南工大生物分离工程(ppt文档).ppt
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1、Chapter 7色谱技术色谱技术Chromatography本章主要知识点本章主要知识点uu什么是色谱分离技术?什么是色谱分离技术?uu色谱分离技术的分类色谱分离技术的分类uu什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算?什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算?uu吸附色谱及其分类和基本原理吸附色谱及其分类和基本原理uu什么是分配色谱?什么是分配色谱?uu离子交换色谱的分类及应用离子交换色谱的分类及应用uu凝胶色谱的分离原理及分类凝胶色谱的分离原理及分类uu离子交换及疏水作用层析的原理离子交换及疏水作用层析的原理uu高效液相色谱的分离原理及应用高效液相色谱的分离原理及应用uu蛋白质分离的常用色谱方法有
2、哪些?蛋白质分离的常用色谱方法有哪些?色谱技术(分配色谱)uu概念:色谱技术是一组相关分离方法的总称,色概念:色谱技术是一组相关分离方法的总称,色谱柱的一般结构含有谱柱的一般结构含有固定相固定相(多孔介质)和(多孔介质)和流动流动相相(气体或液体气体或液体),根据物质在两相间的,根据物质在两相间的分配行为分配行为不同不同(由于亲和力差异),(由于亲和力差异),经过多次分配经过多次分配(吸附(吸附-解吸解吸-吸附吸附-解吸解吸),达到分离的目的。),达到分离的目的。色谱分离方法的分类色谱分离方法很多,种类有四、五十种色谱分离方法很多,种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法,按机理分,但
3、常用于生物大分子分离的色谱方法,按机理分,有以下几种:有以下几种:吸附色谱吸附色谱利用物理吸附性能的差异,吸附力不同利用物理吸附性能的差异,吸附力不同分配色谱分配色谱 利用两液相间分配系数的不同利用两液相间分配系数的不同离子交换色谱离子交换色谱 利用离子交换原理,化学亲和力不同利用离子交换原理,化学亲和力不同凝胶色谱凝胶色谱 利用分子大小或形状差异(排阻作用力的不利用分子大小或形状差异(排阻作用力的不同)同)色谱法简单分类色谱法简单分类色谱系统的基本组成色谱分离的基本概念uu分配系数分配系数uu可由可由LangmuirLangmuir方程得出方程得出uuK Kd d-分配系数分配系数uuq q
4、、c-c-溶质在固相和液相中的浓度溶质在固相和液相中的浓度uu保留时间(保留时间(t tR R)和保留体积(和保留体积(V VR R)uu反应样品在柱子中的保留或阻滞能力,是色谱过反应样品在柱子中的保留或阻滞能力,是色谱过程的基本热力学参数之一程的基本热力学参数之一uu阻滞因子阻滞因子R Rf fuu阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物(与阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物(与固定相没有亲和力的流动相固定相没有亲和力的流动相 KKd d=0=0)的迁移率之比的迁移率之比uu体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,A As s:固定相固定
5、相固定相固定相平均截面积,平均截面积,平均截面积,平均截面积,A Amm:流动相平均截面积流动相平均截面积流动相平均截面积流动相平均截面积uu洗脱体积洗脱体积V Ve euu色谱柱中,使溶质从柱中流出所需流动相体积,色谱柱中,使溶质从柱中流出所需流动相体积,为洗脱体积为洗脱体积uu不同的溶质,由于和固定相的亲和力的不同,洗不同的溶质,由于和固定相的亲和力的不同,洗脱体积也有所差异脱体积也有所差异,V Vmm:色谱柱中流动相体积,色谱柱中流动相体积,色谱柱中流动相体积,色谱柱中流动相体积,V Vs s色谱柱中固相体积色谱柱中固相体积色谱柱中固相体积色谱柱中固相体积uu色谱柱的理论塔板数、塔板高度
6、色谱柱的理论塔板数、塔板高度uu反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系柱高之间的关系uu理论塔板数的计算方法:理论塔板数的计算方法:uuN-N-理论塔板数理论塔板数 t tR R-保留时间保留时间uuWW1/21/2-半峰宽半峰宽 WWb b-峰底宽度峰底宽度uu理论塔板高度:理论塔板高度:L-L-柱长柱长吸附色谱uu原理原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力,包范德华力,包括色散力、诱导力、定向力以及氢键括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离,的差异而实现分离,吸附吸附 解吸
7、解吸再吸附再吸附 再解吸再解吸 反复多次洗脱反复多次洗脱被测组被测组分分配系数不同分分配系数不同 差速迁移差速迁移 分离分离uu关键要素:吸附剂和展开剂的选择关键要素:吸附剂和展开剂的选择关键要素:吸附剂和展开剂的选择关键要素:吸附剂和展开剂的选择uu吸附剂:氧化铝、硅胶、聚酰胺等,均含有不饱和的氧原吸附剂:氧化铝、硅胶、聚酰胺等,均含有不饱和的氧原吸附剂:氧化铝、硅胶、聚酰胺等,均含有不饱和的氧原吸附剂:氧化铝、硅胶、聚酰胺等,均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团,如子或氮原子以及能够形成氢键的基团,如子或氮原子以及能够形成氢键的基团,如子或氮原子以及能够形成氢键的基团,如-O
8、H-OH和和和和-NH-NH2 2 分离机制:分离机制:各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离Adsorption chromatography常用的吸附剂:常用的吸附剂:u氧化铝:氧化铝:有碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝。有碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝。碱性氧化铝,混有碳酸钠等成分而带有碱性,碱性氧化铝,混有碳酸钠等成分而带有碱性,适用分离一些碱性成分适用分离一些碱性成分,如,如生物碱类,但是不宜用于醛、酮、酯、内酯等类型的化合物分离,因为有时生物碱类
9、,但是不宜用于醛、酮、酯、内酯等类型的化合物分离,因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应,如异构化、氧化、消除反应等。碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应,如异构化、氧化、消除反应等。中性氧化铝是由碱性氧化铝除去碱性杂质,冲洗至中性。仍属于碱性吸附中性氧化铝是由碱性氧化铝除去碱性杂质,冲洗至中性。仍属于碱性吸附剂的范畴,剂的范畴,不适用于酸性成分的分离。不适用于酸性成分的分离。酸性氧化铝是氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理得到的产物,并使氧化铝颗粒酸性氧化铝是氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理得到的产物,并使氧化铝颗粒表面带有表面带有 NO3-或或 Cl-的阴离子,从而具有离子交换剂的性质,的阴离子,从而具
10、有离子交换剂的性质,酸性氧化铝适酸性氧化铝适合于酸性成分的柱色谱。合于酸性成分的柱色谱。u硅胶:硅胶:适用于中性或酸性成分的柱色谱。硅胶是一种弱酸性阳离子交换剂适用于中性或酸性成分的柱色谱。硅胶是一种弱酸性阳离子交换剂,其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,通过离子交换反应吸附化合物。其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,通过离子交换反应吸附化合物。硅胶作为吸附剂有较大的吸附容量,硅胶作为吸附剂有较大的吸附容量,能用于极性和非极性化合物的分离能用于极性和非极性化合物的分离u活性炭:活性炭:柱色谱用的活性炭,最好选用颗粒活性炭。柱色谱用的活性炭,最好选用颗粒活性炭。活性炭是非极性吸活性炭是非极性
11、吸附剂,其吸附作用与硅胶和氧化铝相反,对非极性物质具有较强的亲和附剂,其吸附作用与硅胶和氧化铝相反,对非极性物质具有较强的亲和能力,在水溶液中吸附力最强,在有机溶剂中较弱,因此水的洗脱能力能力,在水溶液中吸附力最强,在有机溶剂中较弱,因此水的洗脱能力最弱而有机溶剂较强。最弱而有机溶剂较强。主要分离水溶性成分,氨基酸、糖、苷等。主要分离水溶性成分,氨基酸、糖、苷等。u聚酰胺:聚酰胺:为高分子聚合物质,不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙为高分子聚合物质,不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂,对碱较稳定,对酸稳定性较差,可溶于浓盐酸、冰酮等常用有机溶剂,对碱较稳定,对酸稳定性较差,
12、可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。醋酸及甲酸。聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附,通过分子中的,通过分子中的酰酰胺羰基胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基,或酰胺键上的与酚类、黄酮类化合物的酚羟基,或酰胺键上的游离氨基游离氨基与醌类、与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附的强弱则取决与各种吸附的强弱则取决与各种化合物与之形成氢键缔合的能力。化合物与之形成氢键缔合的能力。主要用于分离黄酮类、蒽醌类、酚类、主要用于分离黄酮类、蒽醌类、酚类、有机酸类、鞣质类等成分。有机酸类、鞣质类等成分。展开剂的选择uu展开剂极性越大,
13、对同一化合物的洗脱能力越大展开剂极性越大,对同一化合物的洗脱能力越大uu因此,可以根据实验结果调整展开剂的极性以获因此,可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果得最佳的分离的效果uu展开剂选择的原则:展开剂选择的原则:(1 1)对被分离组分应具有一定的解吸附能力,极)对被分离组分应具有一定的解吸附能力,极性应比被分离物质的极性略小性应比被分离物质的极性略小(2 2)展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力)展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力常用展开剂的洗脱能力及极性比较uu见书上151152一般吸附色谱的操作程序uu根据要分离组分的性质(包括极性、分子量、根据要分离组分的性质(
14、包括极性、分子量、分子结构)选择合适的固定相和流动相分子结构)选择合适的固定相和流动相uu吸附操作:选择合适的操作条件(温度、吸附操作:选择合适的操作条件(温度、pHpH值、值、流速),进行装柱、平衡、上样,测定穿透样流速),进行装柱、平衡、上样,测定穿透样品含量以调整操作参数品含量以调整操作参数uu洗脱:采用有机溶剂洗涤、调节洗脱:采用有机溶剂洗涤、调节pHpH值以及体系值以及体系离子强度,最大限度地回收目标产物离子强度,最大限度地回收目标产物分配色谱分配色谱uu原理:利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离原理:利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离原理:利用溶质在固定相
15、和流动相之间的分配系数不同而分离原理:利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法的方法的方法的方法uu要素:要素:要素:要素:固定相、载体、流动相固定相、载体、流动相固定相、载体、流动相固定相、载体、流动相 固定相固定相机械吸附在惰性载体上的液体机械吸附在惰性载体上的液体 流动相流动相必须与固定相不为互溶必须与固定相不为互溶 载体载体惰性,性质稳定,惰性,性质稳定,不与固定相和流动相发生化学反应不与固定相和流动相发生化学反应uu分配色谱适合分离极性基团相同而非极性部分差异教大分配色谱适合分离极性基团相同而非极性部分差异教大分配色谱适合分离极性基团相同而非极性部分差异教大分配色谱适合
16、分离极性基团相同而非极性部分差异教大,或溶或溶或溶或溶解度相差较大解度相差较大解度相差较大解度相差较大,或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物u分离机制:利用组分在流动相和固定相间溶解度差别进行分离分离机制:利用组分在流动相和固定相间溶解度差别进行分离uu载体:通常为惰性材料,能吸附固定相液体载体:通常为惰性材料,能吸附固定相液体uu载体种类:载体种类:硅胶硅胶 硅藻土硅藻土 纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶uu固定相:固定相:通常选取各组分溶解度大的通常选取各组分溶解度大的溶剂溶剂作为
17、作为固定相固定相uu展开剂的选择展开剂的选择:选择各组分溶解度相差大的溶选择各组分溶解度相差大的溶剂剂 展开剂事先用固定相饱和展开剂事先用固定相饱和,防止破坏固定相防止破坏固定相uu流动相可以是流动相可以是极性的极性的(反相色谱反相色谱法),也可以法),也可以是是非极性非极性的(的(正相色谱正相色谱)*反相色谱固定相是非极性的反相色谱固定相是非极性的,流动相是极性的流动相是极性的离子交换色谱uu以离子交换树脂作为固以离子交换树脂作为固以离子交换树脂作为固以离子交换树脂作为固定相,选择合适的溶剂定相,选择合适的溶剂定相,选择合适的溶剂定相,选择合适的溶剂作为流动相,作为流动相,作为流动相,作为流
18、动相,uu分离机制:使溶质按照分离机制:使溶质按照分离机制:使溶质按照分离机制:使溶质按照其离子交换亲合力的不其离子交换亲合力的不其离子交换亲合力的不其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法同而得到分离的方法同而得到分离的方法同而得到分离的方法常用的离子交换树脂uu葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶型 DEAE-DEAE-SephadexSephadex A-25 A-25,QAE-QAE-SephadexSephadex A-25 A-25,CM-CM-SephadexSephadex C-25 C-25,SP-SP-SephadexSephadex C-25 C-25uu纤维素系列离子交换剂纤维素系列离
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