基于免疫调节探讨葛根汤颗粒治疗小鼠病毒性肺炎的作用机制.pdf
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1、中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2132DOI:10.19803/j.1672-8629.20230612 中图分类号:R965.1;R994.11文献标志码:A 文章编号:1672-8629(2024)02-0132-05基金项目:中国中医科学院创新工程重点项目(CI2021A04606);国家重点研发计划(2020YFE0205100)。作者简介:赵荣华,女,博士,副研究员 硕导,中药防治病毒性疾病药效机制研究。*通信作者:崔晓兰,女,博士,研究员,中药防治感染性疾病机制研究。E-mail:#为共同通信作者。基于免
2、疫调节探讨葛根汤颗粒治疗小鼠病毒性肺炎的作用机制赵荣华1,孙静1,包蕾1,耿子涵1,陶夏莉2,张敬升1,庞博1,徐英莉1,曹姗1,李舒冉1,郭姗姗1,王道涵3#,崔晓兰1*(1中国中医科学院中药研究所生物安全实验室,北京 100700;2北京瑞诺众德科技有限公司,北京 100095;3北京中医药大学东方医院儿科,北京 100078)摘要:目的研究葛根汤颗粒对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)致小鼠病毒性肺炎模型的药效评价及免疫调节作用。方法ICR小鼠,1315 g,分为正常对照组、模型对照组,磷酸奥司他韦阳性药对照组及葛根汤颗粒高、中、低剂量组(6.6、3.3、1.7
3、g-1kg-1d-1),每组 10只,采用 IAV(FM1 株)病毒液感染建立小鼠病毒性肺炎模型,同时给予相关药物治疗。观察各组小鼠肺指数及肺指数抑制率,RT-PCR 法检测肺组织核酸,ELISA 法检测小鼠肺组织因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子 TNF-;同时采用IAV(FM1株)病毒液滴鼻感染小鼠,造成死亡保护模型,观察小鼠感染后2周内的死亡情况,计算小鼠的死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。结果 葛根汤颗粒中剂量组肺指数及肺组织病毒载量显著降低(P0.01),肺指数抑制率为50.73%;葛根汤颗粒高、中剂量组肺组织炎性因子 IL-10 含量显
4、著降低(P0.01)、葛根汤颗粒中、低剂量组肺组织炎性因子 TNF-含量显著降低(P0.01);葛根汤颗粒 3 个剂量组肺组织炎性因子 IL-6 含量显著降低(P0.01);模型组小鼠死亡率 90%,平均存活天数 9.45 d,葛根汤颗粒 3 个剂量组小鼠死亡率显著降低、平均存活天数显著延长,生命延长率显著提高(P0.01)。结论葛根汤颗粒可通过调节模型小鼠免疫炎性因子水平达到改善病毒性肺炎小鼠免疫功能的作用,同时可显著降低模型小鼠肺指数和肺组织病毒载量,从而减轻模型小鼠的肺部炎性损伤;对模型小鼠有死亡保护作用。关键词:甲型流感病毒;葛根汤颗粒;炎性因子;免疫调节;死亡保护;肺指数;小鼠Mec
5、hanisms of Gegen Tang granules against viral pneumonia in mice based on immune regulationZHAO Ronghua1,SUN Jing1,BAO Lei1,GENG Zihan1,TAO Xiali2,ZHANG Jingsheng1,PANG Bo1,XU Yingli1,CAO Shan1,LI Shuran1,GUO Shanshan1,WANG Daohan3#,CUI Xiaolan1*(1Biosecurity Laboratory,Institute of Chinese Materia Me
6、dica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;2Beijing Reno Technology Co.,Ltd.,Beijing 100095 China;3Dongfang Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China)Abstract:Objective To study the efficacy and immunomodulatory effects of Gegen Tang granules on vi
7、ral pneumonia induced by influenza A virus(IAV)in mice.Methods ICR mice,1315 g,were divided into the normal control group,model control group,oseltamivir phosphate positive control group and high-,medium-and low-dose Gegen Tang granule groups(6.6,3.3 and 1.7 g-1kg-1d-1),with 10 mice in each group.A
8、viral pneumonia model of mice was established by IAV(FM1 strain)while relevant medication was given.Lung indexes and their inhibitory rate were observed.Levels of nucleic acid in lung tissue were detected by RT-PCR,while interleukin-6(IL-6),interleukin-10(IL-10)and tumor necrosis factor TNF-in lung
9、tissue were detected by ELISA.AV(FM1 strain)virus was used to infect mice with nasal drops,resulting in a death protection model.The death toll of mice within 2 weeks of infection was observed,and the mortality rate,death protection rate,average survival days and life extension rate of mice were cal
10、culated.Results The pulmonary index and viral load of lung tissue were significantly decreased(P0.01),and the inhibitory rate of lung indexes was 50.73%.The content of lung inflammatory factor IL-10 in high and medium dose groups of Gegen Tang granules was significantly decreased (P0.01),so was the
11、content of lung inflammatory factor TNF-in medium and low dose groups of Gegen Tang granules(P0.01).The content of inflammatory factor IL-6 in lung tissue was significantly decreased in the three dose groups of Gegen Tang granules(P0.01).The mortality rate of mice in the model group was 90%,and the
12、average survival was 9.45 days,both of which were significantly decreased in the three dose groups of Gegen Tang granules,while the life extension rate was significantly increased(P0.01).Conclusion Gegen Tang granules can improve the immune function of mice with viral pneumonia by adjusting the leve
13、l of immune inflammatory factors while significantly reducing the lung index and viral load of the model mice so as to alleviate the pulmonary inflammatory damage to the model mice.They can help protect model mice from death.Keywords:influenza A virus;Gegen Tang granules;inflammatory factors;immune
14、regulation;death protection;lung index;mice中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2133甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)导致的肺部感染疾病,已严重影响人类健康和威胁公共卫生安全1-3。据世界卫生组织统计,每年季节性流感导致的重症病例已达 300500万人,年死亡数上线接近 65万人,尤其对孕妇、婴幼儿、老年人及有基础病人群重症率和死亡率直线上升4-6,因此,寻找耐药性强和临床疗效好的抗流感病毒药物是预防和控制流感的必要手段之一。中医药在治疗病毒感染性疾病方
15、面有其悠久的历史和理论基础,流感属中医疫病中的“时行感冒”范畴,瘟疫论7认为“瘟疫之为病,非风、非寒、非暑、非湿,乃天地间别有一种异气所感”,“感天地之异气此气之来,无论老少强弱,触之者即病”。因此,流感不同于普通“感冒”,具有突然爆发,快速蔓延,起病急骤,病情较重,并发症多发的特点8-10。葛根汤颗粒由葛根、麻黄、白芍、桂枝、甘草、大枣、生姜组成,具有发汗解表,升津舒筋的功效。本研究中选择葛根汤颗粒作为治疗药物,通过对感染模型小鼠肺组织炎症损伤、肺组织核酸及肺组织免疫炎性因子等指标变化的探查,揭示其治疗流感病毒致小鼠肺炎模型的作用机制。1 材料1.1 动物ICR 幼龄小鼠,SPF 级,体质量
16、(141)g,雌雄各半,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物合格证号:SCXK(京)2016-0006,合格证号:1100112111106103862、110011211106103978、110011211106140787、110011211106140838。饲养条件:ABSL-2 实验室,-20 Pa,环境温度 2123,湿度40%50%,实验操作严格按照生物安全实验室管理要求完成,符合北京市实验动物伦理委员会规定,由中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会给予批准,批准号:2021D056。1.2 病毒毒株甲型 H1N1 流感病毒(FM1 株),购自美国标准生物品收藏中心(A
17、TCC)。由本所 ABSL-2+生物安全实验室常规传代,-80冰箱保存备用。1.3 药物及试剂葛根汤颗粒(瑞阳制药股份有限公司,批号:21032321,每袋 6 g);磷酸奥司他韦颗粒(宜昌东阳光长江药业股份有限公司,批号:0651912300,每袋15 mg);日本葛根汤1(tsumura 津村株式会社,批号:R24831,每袋 2.5 g);日本葛根汤 2(井藤汉方制药株式会社,批号:AA0442-6,每袋 1.5 g);异氟烷(上海玉研科学仪器有限公司,批号:S200106);甲型 H1N1流感病毒 PCR 试剂盒(上海之江生物科技股份有限公司,批号:P20200101);IL-6、TN
18、F-试剂盒(莱兹生物科技有限公司,批号:269392-001、234889-020)、IL-10 试剂盒(上海酶联,批号:05/2021)。1.4 仪器A2型生物安全柜(美国Thermo 公司,型号:MSC-Advantage 1.8);电子天平(上海越平科学仪器有限公司,型号:YP1002);电子分析天平(美国Ohaus公司,型号:AR1140);IVC 小鼠饲养笼(苏州冯氏股份有限公司,型号:ZJ-4);Real-Time PCR 仪(美国 Applied biosystems 公司,型号:QuantStudio 5);八连排管迷你离心机(Kylin-Bell Lab 公司,型号:LX-3
19、00);迷你涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器公司,型号:OL-901);低温高速离心机(德国 Eppendorf公司,型号:Eppendorf-5810R);多功能酶标仪(德国 Perkin Elmer 公司,型号:Enspire);组织匀浆仪(美国 MP 公司,型号:FastPre-24TM)。2 方法2.1 剂量设计葛根汤颗粒,人临床用量为18 g60 kg-1d-1,即 0.3 g kg-1体重,实验时小鼠用量分别设 6.6、3.3、1.7 gkg-1d-1 3 个剂量,分别相当于临床 2 倍、等倍及 1/2 倍剂量。日本葛根汤1:人临床用量为 5 g60 kg-1 d-1,即0.083
20、g kg-1体重,实验时小鼠用量为 0.9 g kg-1 d-1;日本葛根汤 2:人临床用量为 4.5 g60 kg-1d-1,即0.075 g kg-1体重,实验时小鼠用量为 0.8 g kg-1 d-1;磷酸奥司他韦颗粒:人临床用量为150 mg 60 kg-1 d-1,即2.5 mg kg-1体重,实验时小鼠用量为27.5 mg kg-1 d-1;均相当于人临床等倍剂量。给药时:按 0.2 g 10 mL-1d-1给予灌胃给药,每日1次,连续 4 d。2.2 实验造模小鼠病毒性肺炎模型:取 ICR 小鼠 80只,体重(141)g,雌雄各半,按体重等级随机分为 8 组,分别为正常对照组、模
21、型对照组、磷酸奥司他韦对照组、日本葛根汤1 对照组、日本葛根汤 2 对照组、葛根汤颗粒高、中、低 3 个剂量组,每组10只。除正常对照组外,将小鼠用异氟烷轻度麻醉,以15 个 LD50流感病毒液(H1N1/FM1株)滴鼻感染,每只 35 L。感染中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2134当天开始给药,每次按 0.2 mL 10 g-1灌胃,每日1次,连续 4 d,正常对照组和模型对照组在同等条件下以蒸馏水灌胃。第 5 天各组小鼠称体重;解剖称肺重,取肺组织一部分进行核酸检测,另一部分进行肺组织炎性因子检测。小鼠死亡保护模
22、型:取 ICR 小鼠 140 只,体重(141)g,雌雄各半,按体重等级随机分为 7 组,分别为模型对照组、磷酸奥司他韦对照组、日本葛根汤1对照组、日本葛根汤 2 对照组、葛根汤颗粒高、中、低 3个剂量组,每组 20只。各组小鼠用异氟烷轻度麻醉,以 2 个 LD50流感病毒液(FM1株)滴鼻感染,每只 35 L。感染当天开始给药,各组小鼠每次按 0.2 mL 10 g-1灌胃,每日1次,连续 4 d,模型对照组在同等条件下以蒸馏水灌胃。观察感染后 2周内动物的死亡情况。肺指数及肺指数抑制率计算方法,计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率详见公式。肺指数(%)=肺湿重(g)/体重(g)
23、100 公式(1)肺指数抑制率(%)=100模型对照组肺重(g)-给药组肺重(g)模型对照组肺重(g)-正常对照组肺重(g)公式(2)死亡率(%)=死亡数(只)/动物总数(只)100 公式(3)死亡保护率(%)=100模型对照组死亡率(%)-给药组死亡率(%)模型对照组死亡率(%)公式(4)生命延长率(%)=100给药组存活天数(d)-模型对照组存活天数(d)模型对照组存活天数(d)公式(5)2.5 RT-PCR 法检测肺组织核酸含量 核酸提取:将小鼠肺组织从-80低温冰箱中取出,每个肺组织加入 1 mL TRIzol Reagent,进行组织匀浆;提取肺组织中 RNA;核酸检测:DEPC-H
24、2O作为阴性对照,阳性对照品进行10、100、1 000 倍梯度稀释;取 n18 L 甲型流感病毒核酸荧光 PCR 检测混合液,n1 L 内部对照品,与 n1 L RT-PCR酶(n 为反应管数),3 000 rpm 离心数秒;取上述混合液 20 L置于 PCR 管中,然后将样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照品各 5 L 分别加入 PCR管中,进行 PCR 扩增反应;上机检测:循环参数设置为:4510 min;9515 min,再按 9515 sec 6060 sec,循环 40 次,单点荧光检测在60,反应体系为 25 L;选用 FAM 和 HEX/VIC/JOE 通道,上机检测。2
25、.6 Elisa 法检测小鼠肺组织 IL-6、IL-10、TNF-含量将肺组织从-80低温冰箱中取出,用高效蛋白裂解液(已加入 PMSF及蛋白酶抑制剂)处理肺组织后离心,取蛋白上清用于检测。检测时按照试剂盒说明书检测,用酶标仪检测 450 nm 的吸光度。2.7 统计分析采用 SPSS19.0 软件进行数据分析,以 sx表示,采用 t 检验进行组间比较,P0.05 表示差异有统计学意义。3 结果3.1 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺指数及肺指数抑制率的影响采用甲型 H1N1 流感病毒(FM1 株)感染小鼠后,模型对照组小鼠肺指数明显增高,与正常对照组比较有显著差异(P0.01);感染当天开始
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