华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因PcoPMK克隆与表达分析.pdf
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1、Vol.44 No.3Mar.2024第 44 卷 第 3 期2024 年 3 月中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Journal of Central South University of Forestry&Technologyhttp:/收稿日期:2023-08-04基金项目:湖南省自然科学基金项目(2023JJ30358);湖南省林业科技创新杰出青年培养科研项目(XLK202108-6)。第一作者:舒东膂(),副研究员。通信作者:严佳文(),副研究员,博士。引文格式:舒东膂,李建挥,禹霖,等.华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆与表达分析 J.中南林业科技大学学报,20
2、24,44(3):117-125.SHU D L,LI J H,YU L,et al.Cloning and expression analysis of phosphomevalonate kinase gene PcoPMK in Prunus conradinaeJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2024,44(3):117-125.华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆 与表达分析舒东膂,李建挥,禹 霖,柏文富,杨 扬,胡景堃,严佳文(湖南省植物园,湖南 长沙 410116)摘 要:【目的】
3、克隆华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 的 cDNA 序列,分析该基因在华中樱YS01不同发育阶段花瓣中的表达情况及其编码蛋白质的结构特征和理化性质,为进一步研究 PcoPMK 基因在华中樱萜烯类物质合成途径中的功能提供参考。【方法】参照近缘物种的 PMK 同源基因 cDNA 保守序列设计特异性引物,应用 RT-PCR 技术扩增 PcoPMK 基因的 cDNA 序列,并进行克隆测序,同时应用定量 RT-PCR 技术分析该基因在YS01不同发育阶段花瓣中的表达情况。应用 ORF Finder 在线工具预测基因的开放阅读框及编码的蛋白质序列;分别应用 ExPASy、SOPMA、Swiss m
4、odel 和 CDD 在线工具分析蛋白质的理化性质、二级、三级结构和功能结构域;分别应用 DeepTMHMM、SINALP 4.0 Server 和 PredictProtein 在线程序预测蛋白质的跨膜结构、信号肽和亚细胞定位;应用 MEGA7.0 软件构建基因的系统进化树。【结果】华中樱 PcoPMK 基因开放阅读框序列大小为 1 530 bp,编码 509 个氨基酸,GenBank 登录号为 OR373074。编码蛋白质的相对分子量为 55.199 kD,理论等电点为 5.68,属于亲水性的稳定蛋白,定位于细胞质。PcoPMK 蛋白与扁桃、烟草和拟南芥等代表性物种 PMK 同源蛋白的序列
5、相似度较高,含有 3 个典型且保守的蛋白结构功能域和 1 个 ATP 结合位点,无跨膜螺旋和信号肽,属于非分泌蛋白。PcoPMK 基因在华中樱YS01盛开期花瓣中的相对表达量显著高于花蕾期和半开期(P 0.05),与同时期花瓣中萜烯类香气物质的含量变化规律一致。【结论】本研究成功克隆了华中樱 PcoPMK 基因,初步推测其可能在花瓣萜烯类物质合成途径中发挥重要作用,为进一步研究该基因的生物学功能提供了参考。关键词:华中樱;磷酸甲羟戊酸激酶基因;RT-PCR;基因克隆中图分类号:S792.99 文献标志码:A 文章编号:1673-923X(2024)03-0117-09Cloning and e
6、xpression analysis of phosphomevalonate kinase gene PcoPMK in Prunus conradinaeSHU Donglyu,LI Jianhui,YU Lin,BAI Wenfu,YANG Yang,HU Jingkun,YAN Jiawen(Hunan Botanical Garden,Changsha 410116,Hunan,China)Abstract:【Objective】The objective of this study was to clone the cDNA sequence of the phosphomeval
7、onate kinase gene of Prunus conradinae,and analyze the expression level of this gene in the petals of the YS01 at different developmental stages,as well as the structural characteristics and physicochemical properties of the encoded protein,so as to provide a reference for further research on the fu
8、nction of PcoPMK gene in the synthesis pathway of terpenoids in P.conradinae.【Method】The specific primers had been designed with reference to the conserved cDNA sequence of homologous PMK gene of related species.The cDNA sequence of the PcoPMK gene was amplified using RT-PCR technology,and cloned fo
9、r sequencing.In addition,quantitative RT-PCR technology was used to analyze the expression level of the gene in the petals of YS01 at different developmental stages.ORF Finder online tool was used to predict gene open reading frame and encoded protein sequence.The physicochemical properties,secondar
10、y structures,tertiary structures,and functional domains of the PcoPMK protein were analyzed using ExPASy,SOPMA,Swiss model,and CDD online tools,respectively.The transmembrane structure,signal peptide and subcellular localization of the PcoPMK protein were predicted by DeepTMHMM,Doi:10.14067/ki.1673-
11、923x.2024.03.012舒东膂,等:华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因 PcoPMK 克隆与表达分析118第 3 期华中樱 Prunus conradinae 又叫华中樱桃,是中国特有的野生樱花,生长于海拔 500 2600 m的沟边林中1。华中樱分布广泛,适应性强,自然条件下与其他樱属植物发生天然杂交的现象较为常见2,因此具有较高的遗传变异和形态多样性3-5,主要表现为花色、花型、花期等表型差异6。近期研究表明,华中樱的香气性状也存在明显差异:如新品种婉梅7、楚锦8和大多数野生资源没有香气或香气不明显;而野生资源YS019则花朵芳香,其盛花期花瓣中共有49种香气物质,其中萜烯类化合物有 4
12、种,相对含量为 6.13%,是YS01盛花期花瓣中的主要香气成分9。植物组织中的萜烯类化合物通过甲羟戊酸途 径(mevalonate pathway,MVA)和 甲 基 赤 藓醇 磷 酸 途 径(methylerythritol phosphate pathway,MEP)合成,其底物是异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和 二 甲 烯 丙 基 焦 磷 酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)10。MVA途径合成 IPP 和 DMAPP 涉及 6 个关键酶,其中磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kina
13、se,PMK)是该途径中重要的限速酶,其功能是转移腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)上的 磷酸基团到甲羟戊酸-5-磷酸(mevalonate-5-phosphate,MVAP),生 成 甲 羟 戊 酸-5-二 磷酸(mevalonate-5-pyrophosphate,MVAPP)11。PMK 酶是萜烯类物质合成途径中的关键酶之一,是重要的调控位点12。Sando 等13克隆了橡胶树(Hevea brasiliensis)HbPMK 基因并应用酵母功能互补实验分析了其功能。Woo 等 14在大肠杆菌中过量表达黄花蒿(Artemisia annua)AaPM
14、K 基因,成功地将转化菌株中的萜烯类化合物含量提高了 3 倍。Yuan 等15分析了与芍药苷及其衍生物生物合成相关的 24 个候选基因的表达情况,结果表明芍药(Paeonia lactiflora)PlPMK 基因的表达量与芍药苷和苯甲酰芍药苷等单萜苷类物质的含量显著正相关。Pathak 等16将杧果(Mangifera indica)MiPMK 基因沉默后,发现果实中的香叶基香叶醇、反式法尼醇和-石竹烯等萜烯类物质及其衍生物的含量显著降低。以上研究结果进一步证实了 PMK 基因在植物萜烯类物质合成途径中发挥重要作用,此外,丹参 Salvia miltiorrhiza17、拟 南 芥 Arab
15、idopsis thaliana18、阳 春 砂 Amomum villosum19、独 行 菜 Lepidium apetalum20、茉莉 花 Jasminum sambac21、香 樟 Cinnamomum camphora22、小 麦 Triticum aestivum23、白 檀Santalum album24、紫苏 Perilla frutescens25、菊叶薯蓣 Dioscorea composita26和茅苍术 Atractlodes lancea27等植物的 PMK 同源基因也已被成功克隆。华中樱 PMK 同源基因尚未见研究报道,其在花瓣萜烯类物质合成途径中的生物学功能还不
16、清楚。本研究以花朵香气明显的华中野生樱资源YS01为材料,参考甜樱桃 Prunus avium、梅花 P.mume 和扁桃 P.dulcis 等近缘物种的 PMK 同源基因 cDNA 序列设计特异性引物,采用 RT-PCR技术从 YS01 盛花期花瓣中克隆了PcoPMK基因,并分析了其编码蛋白质的结构特征以及在 YS01不同发育阶段花瓣中的表达情况,以期为进一步研究 PcoPMK 基因的功能,阐明华中樱萜烯类物质的生物合成途径奠定基础。1 材料与方法1.1 试验材料采集华中樱野生资源YS01花蕾期(开放前5 d)、半开期和盛开期3个发育阶段花瓣各5 g,液氮速冻10 min,置于-80 超低温
17、冰箱保存备用。1.2 试验方法1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成华中樱野生种质YS01不同发育阶段花SINALP 4.0 Server and PredictProtein online programs,respectively.The phylogenetic tree of the PcoPMK gene was constructed using MEGA7.0 software.【Result】The open reading frame sequence of PcoPMK gene in P.conradinae was 1 530 bp in length,encodi
18、ng 509 amino acids.PcoPMK protein belonged to hydrophilic stable protein without transmembrane helix and signal peptide,which was located in the cytoplasm.Its relative molecular weight was 55.199 kD,and theoretical isoelectric point was 5.68.The PcoPMK protein had high sequence similarity with PMK h
19、omologous proteins of representative species,such as almond,tobacco,and arabidopsis.It contained three typical and conservative domains,and one ATP binding site.The relative expression level of the PcoPMK gene in the petals of the full opening stage was significantly higher than that in bud and half
20、 opening stage in P.conradinae YS01(P 0.05),which was consistent with the trend of changes in the content of aromatic terpenes in the petals.【Conclusion】In this study,the PcoPMK gene is successfully cloned,and it is speculated that it may play an important role in the synthesis pathway of terpenes i
21、n the petals of P.conradinae YS01.These results will provide a reference for further research on the biological function of PcoPMK gene in P.conradinae.Keywords:Prunus conradinae;phosphomevalonate kinase gene;RT-PCR;gene cloning119中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷瓣总 RNA 提取方法参照植物总 RNA 提取试剂盒(Vazyme,#R701)说 明
22、书。应 用 NanoDrop 2000c 微量分光光度计(Thermo scientific)和 1%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 浓度和纯度,具体参照张美玲等28的方法。质量合格的样品用于cDNA第一链合成,具体方法参考试剂盒(Vazyme,#R212)说明书。制备的cDNA置于-30 冰箱备用。1.2.2 基因克隆和测序在 NCBI 数 据 库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载华中樱近缘物种的 PMK 同源基因的cDNA 序列,物种和基因登录号分别为甜樱桃(XM_021952904.1)、梅花(XM_016795883.1)、扁 桃(XM_034360282.
23、1)和 桃(P.persica)(XM_020564058.1)。应用 DNAMAN9.0 软件对4 个近缘物种的 PMK 同源基因 cDNA 序列进行多重比对,应用 Primer premier 6.0 软件在 5 端和 3端的高度保守区设计 PCR 特异性引物(表 1),RT-PCR扩增华中樱PMK同源基因的cDNA序列,PCR 反应体系及程序参照试剂(Vazyme,#P505)说明书,退火温度设置为 54。PCR 产物纯化后连接到 pCE2TA/Blunt-Zero 载体,然后热激转化至DH5 大肠杆菌感受态细胞(Vazyme,#C502),在含 100 g/mL 氨苄青霉素(Coola
24、ber,#CA2031-5 g)的 LB 固体培养基培养 16 h,PCR 产物纯化和热激转化方法参照试剂盒(Vazyme,#DC301;#C601-01)说明书。随机挑选 10 个单菌落,以M13 通用引物进行 PCR 鉴定,反应体系及程序参照 TA 克隆试剂盒(Vazyme,#C601-01)说明书。阳性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。表 1 基因克隆与定量 RT-PCR 引物Table 1 The primers for gene cloning and quantitative RT-PCR analysis引物用途 Primer application引物编号 Pr
25、imer No.引物序列(5-3)Primer sequences基因克隆PcoPMKFCCAACTACTGAGAGTCCGAGAG Gene cloningPcoPMKRCACACTCTAATACAATTCCTCTTGC定量 RT-PCRqPcoPMKFAGCAAGCCGCTAAACCAAACQuantitative RT-PCRqPcoPMKRATCAAACCCACCTGCTCCAActinFGATGCTGAGGACATTCAACCCActinRCCAGCAAGGTCCAGACGAAG1.2.3 基因序列分析和进化树构建应用 ORF Finder(https:/www.ncbi.nlm.n
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