基于LC-MS_MS测定人体类固醇激素的研究进展.pdf
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1、第45卷第2 期2024年3月质谱学报Journal of Chinese Mass Spectrometry SocietyVol.45No.2Mar.2024基于 LC-MS/MS 测定人体类固醇激素的研究进展万薇1-2,谢洁,屈子裕,江王一楠,戴新华,方(1.中国计量大学生命科学学院,浙江杭州310 0 0 0;2.中国计量科学研究院前沿计量科学中心,国家市场监管技术创新中心(质谱),北京10 0 0 2 9;3.长春市计量检定测试技术研究院,吉林长春130 0 0 0)游?,张谛,黄泽建,向?,叶子弘1摘要:类固醇激素是一类具有环戊烷多氢菲结构的化合物,由细胞色素P450酶催化形成,在
2、调节机体代谢、促进性器官发育等方面起着重要作用。临床上将类固醇激素水平作为肾上腺疾病、精神类疾病等的诊断指标。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用技术因具有高灵敏度、高通量和高专属性的特点,已成为类固醇临床测定的首选方法。本文综述了LC-MS/MS在内源性类固醇激素测定中的应用,特别是在样品前处理、色谱条件和质谱条件优化等方面的研究进展,为临床上类固醇激素的诊断检测提供参考。关键词:类固醇激素;液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS);样品前处理;色谱条件;质谱条件中图分类号:0 6 57.6 3doi:10.7538/zpxb.2023.0073文献标志码:A文章编号:10 0 4-2
3、9 9 7(2 0 2 4)0 2-0 2 0 1-15Research Progress in the Determinationof Human Steroid Hormones Based on LC-MS/MSWAN Weil-2,XIE Jie,QU Zi-yu?,JIANG You?,ZHANG Di?,HUANG Ze-jian?,WANG Yi-nan,DAI Xin-hua,FANG Xiang,YE Zi-hong(1.College of Life Sciences,China Jiliang University,Hangzhou 310000,China;2.Tech
4、nology Innovation Center of Mass Spectrometry for State Market Regulation,Center for Advanced Measurement Science,National Institute of Metrology,Beijing 1o0029,China;3.Changchun Metrological Verification and Testing Technology Research Institute,Changchun 130000,China)Abstract:In human body,the end
5、ocrine system,nervous system and immune systemjointly shoulder the important responsibility of life support.Hormones are the materialbasis for coordination of endocrine system.Steroid hormones,also known as steridehormone,belong to a large category of hormones.The synthesis process of steroid hor-mo
6、nes takes cholesterol as the precursor.Through the participation of various metabolic国家重点研发计划-重大科学仪器设备开发专项项目(2 0 2 0 YFF01014600);国家自然科学基金-国家重大科研仪器研制项目(2 192 7 8 12);中国计量科学研究院基本业务费项目(AKYZZ2325)本文共同第一作者万薇,谢洁;通信作者叶子弘,谢洁202enzymes,steroid hormones are synthesized in the human adrenal cortex,mitochondri
7、aof placental cells,smooth Endoplasmic reticulum and gonads,producing 21C,19C or18C-backbones with different chemical structures.According to pharmacologicaleffects,steroid hormones are mainly divided into progestogens,corticosteroids and sexhormones,which play an important role in regulating human
8、growth,development,reproduction and maintaining the stability of human body environment.In clinical prac-tice,the level of steroid hormones is used as diagnostic indicator for adrenal and psychi-atric diseases.Therefore,accurate determination of steroid hormone content is veryimportant.Steroid hormo
9、nes in the human body can be detected using various methods,such as radioimmunoassay,chemiluminescence immunoassay,enzyme-linked immu-nosorbent assay,gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS),andliquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).Mass spectrometryhas obvious advanta
10、ges in terms of detection sensitivity and accuracy compared withimmunoassay.GC-MS has been the main technique for steroid analysis due to its highspecificity,wide analyte coverage,and sufficient sensitivity.However,the samplesneed to be derivatized,and the experimental processes are tedious.LC-MS/MS
11、 has theinherent advantages of high sensitivity and specificity,and has a high-throughputcharacteristic,thus it is an ideal tool for routine diagnosis.At present,commonpretreatment techniques for serum samples include protein precipitation,liquid-liquidextraction,and solid phase extraction.Some new
12、pretreatment methods have emergedin recent years,such as dispersed liquid-liquid extraction,ultrasonic-assisted extraction,and supramolecular extraction.Each pretreatment technique has its own advantages anddisadvantages.For example,solid phase extraction(SPE)can achieve good recoverybut requires mo
13、re time and economic factors.In selection of pretreatment methods,thephysical and chemical properties of analytes,the characteristics of matrices,the simplic-ity and durability of method establishment,and time,reliability,and cost requiredshould be comprehensively considered.This article reviewed th
14、e application ofLC-MS/MS in the determination of endogenous steroid hormones,especially in samplepretreatment,chromatographic and mass spectrometric conditions,so as to providemore accurate basis for clinical diagnosis and treatment based on steroid hormones.Key words:steroid hormones;liquid chromat
15、ography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);sample pretreatment;chromatographic conditions;mass spectrometric condi-tions人体内的内分泌系统、神经系统、免疫系统共同承担生命持续的重要责任。激素是内分泌系统实现协调作用的物质基础。类固醇激素(s t e r o i d h o r m o n e)又称笛体激素,属于激素中的一大类,其合成过程以胆固醇为前体,通过各种代谢酶的参与,在人体的肾上腺皮质、胎盘细胞的线粒体、平滑内质网和性腺中合成,产生化学结构不同的2 1C、19C、18
16、C 骨架,合成过程示于图1。根据药理作用,类固醇激素主要分为质谱学报第45卷孕激素、皮质激素、性激素,它们在人体的生长、发育、生殖以及维持体内环境稳定等方面起着重要的调节作用。激素通过在人体靶细胞上与受体结合而发挥作用,具有极高的专属性。当体内类固醇激素水平下降时,机体会产生严重的症候群,甚至危及生命。因此,临床上将类固醇激素水平作为许多疾病的诊断指标,如先天性肾上腺增生、库欣综合征、原发性醛固酮增多症、以及一些精神类疾病 11,示于图2。由于大第2 期OH胆固酮OH17-羟基孕烯醇酮万薇等:基于LC-MS/MS测定人体类固醇激素的研究进展OHOH11-脱氧皮质酮皮质酮OHOH孕烯醇酮-OH2
17、03OHOHOH孕酮17-羟孕酮OH脱氢表雄酮OH18-羟基皮质酮OHOH11-脱氧皮质醇HO4-雄烯二酮雌酮OHOH醛固酮OH-0OHOHH皮质醇OHHO雌二醇OH翠酮图1类固醇激素在人体内的合成路径Fig.1 Synthesis pathways of steroid hormones in the human body盐皮质激素(+)糖皮质激素(-)原发性醛固酮(+)醛固酮增多症先天性雄激素(+)肾上腺皮质增生症21羟化酶缺乏症17-羟孕酮、芳香酶雌激素(一)缺乏症类固醇激素临床应用库欣皮质醇(+)孕酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮(醛固酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇(一)综合征5还原酶缺乏
18、症翠酮(+)三氢睾酮()多囊卵巢雄烯二酮、睾酮(+)综合征图2 类固醇激素含量变化引起的临床疾病Fig.2 Clinical diseases caused by changing the levels of steroid hormones多数激素在体内极微量,且化学性质差异较大,寻找一种准确、特异的分析方法是临床疾病诊断的首要任务。在人体内,内源性类固醇激素含量一般为nmol/L(皮质醇、脱氢表雄酮等)和pmol/L(睾酮、雌酮等)量级,并且根据个体差异而变化,因此,低浓度类固醇激素的准确测定面临巨大挑战 2 。目前,检测人体内类固醇激素的方法包括放射免疫测定法、酶联免疫吸附(ELISA)
19、法、化学发光免疫测定法、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法。其中,质谱法在检测灵敏度和准确度方面具有明显优势,LC-MS/MS可以与高通量分析相结合,是常规检测类固醇激素的理想工具。近年来,基于LC-MS法的激素检测类综述文章侧重点不同。Gravitte等 3 综述了LC-MS/MS在内源性性激素定量中的应用;Hawley等 4 对基于LC-MS/MS法测量内源性糖皮质激素进行综述,涉及血清、尿液和唾液皮质醇;徐玲燕等 5 综述了LC-MS/MS法在临204床内源性类固醇激素分析方面的应用及进展,特别是样品前处理、色谱及质谱条件方面,并简要阐述了
20、该方法在肾上腺皮质激素及性激素测量方面的特点;金陈飞等 6 综述了LC-MS/MS用于先天性肾上腺皮质增生症患者诊治的研究进展,明确了LC-MS/MS有避免非特异性物质干扰、解决免疫分析法的高假阳性、检测标本多样化及能够进行快速类固醇代谢分析的优势;鹿倩等 7 归纳对比了近几年检测血液中类固醇激素常用的分析方法,为类固醇激素水平的准确测定提供了思路。本文将从样品前处理方法、色谱条件、质谱条件,以及质谱新技术等方面进行综述,探究色谱-质谱联用技术在测定人体内类固醇激素方面的研究进展,为肾上腺相关疾病的诊断检测提供参考。1样品前处理质谱技术在临床监测中具有许多优势,但由于样本基质的复杂性,血液、尿
21、液和头发等生物样本不能直接送入质谱仪分析 8 ,需要去除样品中的大分子干扰物,其中的蛋白质会导致仪器堵塞,盐和磷脂引起的基质效应会影响电离效率 9。因此,生物样本需经过一系列的前处理过程以提高分析的准确性和灵敏度 10-1。目前,常用的样品前处理方法有蛋白质沉淀(PPT)12、液液萃取(LLE)13-14和固相萃取(SPE)15。近年来还出现了一些新的前处理方法,如分散液液萃取 16 、超声波辅助提取法 17 和超分子萃取 18 等。为了得到目标化合物高回收率,将多种前处理方法相结合已逐渐受到关注 1-2 0 1。在样品前处理方法选择上,应考虑分析物和样本基质的性质、衡量方法的可行性、以及前处
22、理所需的时间和成本等因素 2 1。1.1蛋白沉淀PPT是通过在生物样品中加人沉淀剂使蛋白质变性沉淀,然后将目标分析物从样品中提取出来的方法 8 。有机溶剂(甲醇、乙腈或丙酮)、酸(三氯乙酸、高氯酸、偏磷酸和钨酸)、盐(氯化铝)和金属离子(硫酸锌)等被认为是PPT中最常用的沉淀剂 2 2 。有机溶剂会干扰蛋白质的分子内疏水相互作用,同时减少水合质谱学报第45卷作用(水化程度较低的蛋白质不易溶解),可溶性蛋白质通常具有被亲水表面包围的疏水中心,这些蛋白质的电离状态可以通过添加酸或碱来改变 12 。Ionita等 2 3 采用LC-MS/MS法检测人血浆中皮质醇、可的松和泼尼松,具有较高的特异性,准
23、确度和精密度均在士15.0%以内。Owen等 2 4 利用LC-MS/MS法分析血清皮质醇,采用硫酸锌沉淀蛋白的前处理方法,血清样本中添加皮质醇后的平均回收率为99.0%,通过与2种商品化免疫测定法对比,该方法具有较高的准确度和精密度。Polson等 2 5 对比了有机溶剂、酸、盐和金属离子4种蛋白质沉淀剂,以评估不同种类沉淀剂的蛋白质去除效率,在血清与沉淀剂体积比为2:1时,乙腈、三氯乙酸、硫酸锌可分别去除92.0%、91.0%、96.0%的血清蛋白,因此认为这3种沉淀剂具有较好的沉淀效果。PPT法简单、快速,但由于提取物的灵敏度和纯净度较低,需要在方法验证阶段反复验证。对于皮质醇或脱氢表雄
24、酮硫酸盐,它们在人体内的含量相对较高,前处理阶段不需要考虑样本被沉淀剂稀释的问题;而对于人体中含量较少的雌二醇或醛固酮等化合物,沉淀剂沉淀不完全会对结果产生较大影响 2 6 。此外,对于某些小分子化合物,该方法并不能很好地消除基质效应,反而会产生较强的基质效应而影响质谱信号 2 7 。随着前处理技术的飞速发展,PPT已作为大多数前处理程序的第一步,后续将结合LLE或SPE纯化和浓缩来实现高灵敏检测10。1.2液液萃取LLE是利用待测物在两相溶液中溶解度的不同,通过涡旋、超声、振荡等手段提取目标物的方法 2 8 ,因样品制备简单而被广泛应用2 9-31。在该方法中,萃取剂的选择非常重要,要求所选
25、溶剂对目标化合物的溶解度较大,且不与目标物发生反应,常用的萃取剂有乙醚、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、正已烷等有机溶剂,以及它们的混合溶剂 32-33采用LC-MS/MS 法检测类固醇激素含量时,朱宇清等 34 和马晓斐等 35 均选择叔丁基甲醚作为提取剂考察血清中皮质激素的提取效果,方法回收率分别为8 4.5%9 0.4%和8 6.6%第2 期万薇等:基于LC-MS/MS测定人体类固醇激素的研究进展102.7%;Schofield等36 采用LC-MS/MS法测定血清中雌二醇和睾酮,使用正已烷和乙酸乙酯混合溶液作为萃取剂进行样品前处理,2 种分析物的日内和日间精密度均小于7.0%,且回收率在9 7
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