富马酸二甲酯对肠道辐射损伤防护作用及机制研究.pdf
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1、中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.183DOI:10.19803/j.1672-8629.20230671 中图分类号:R965文献标志码:A 文章编号:1672-8629(2024)01-0083-06基金项目:国家自然科学基金资助项目(82103776、82192911)。作者简介:张亮亮,男,在读硕士,药理学。*通信作者:高月,女,研究员 博导,中药药理学。E-mail:#为共同通信作者。随着核技术的高速发展,电离辐射(ionizing radiation,IR)在医学诊断、核医学和放射治疗中被富马酸二甲酯对肠道辐射
2、损伤防护作用及机制研究张亮亮1,2,胡昌坤2,3,吴泽坤1,2,周维2,廖泽彬2#,高月1,2*(1广东药科大学药学院,广东 广州 510006;2军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所,北京 100850;3天津中医药大学,天津 301617)摘要:目的研究富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)对全身辐照小鼠小肠辐射损伤的防护作用及机制。方法利用60Co 射线诱导小鼠辐射损伤,取照射后小鼠小肠组织切片行 H&E、TUNEL 染色,观察小肠组织病理学改变及细胞凋亡。通过酶联免疫吸附(ELISA)法测定辐照后小鼠小肠炎症因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介
3、素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-(TNF-)及炎症小体小鼠 NOD 样受体蛋白3(NLRP3)、小鼠黑色素瘤缺乏因子 2(AIM2)含量变化。采用 Western blot 法、免疫荧光染色检测小肠中炎性小体 NLRP3、AIM2 的表达。使用激动剂验证 DMF 对小肠的辐射防护作用。结果在 射线诱导的小鼠全身辐照损伤模型中,DMF(15 mgkg-1)明显改善小肠组织病理状况,降低了辐照后肠道细胞的凋亡。DMF能够显著调节辐照后炎症因子及炎症小体的表达。Western blot 结果和组织免疫荧光染色表明,DMF 能够显著降低 NLRP3、AIM2 表达。DMF与NLRP3、AIM2
4、激动剂联合使用后组织 TUNEL 染色结果表明,DMF 不能减轻小肠组织的细胞凋亡。结论DMF 对 射线诱导的小鼠全身辐射损伤具有保护作用,其作用与抑制 NLRP3/AIM2炎性小体有关,可作为潜在辐射损伤防护药物。关键词:富马酸二甲酯;辐射损伤;炎性小体;肠道损伤;酶联免疫吸附;白介素-1;白介素-6;白介素-18;肿瘤坏死因子-;小鼠Protective effect and mechanism of dimethyl fumarate against intestinal radiation injuryZHANG Liangliang1,2,HU Changkun2,3,WU Zeku
5、n1,2,ZHOU Wei2,LIAO Zebin2#,GAO Yue1,2*(1School of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou Guangdong 510006,China;2Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Academy of Military Sciences,Beijing 100850,China;3Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
6、,Tianjin 301617,China)Abstract:Objective To investigate the protective effect of dimethyl fumarate(DMF)on irradiation(IR)-induced intestinal damage and the underlying mechanism.Methods 60Co ray irradiator was used to induce radiation injury in mice.Small intestines were collected after irradiation a
7、nd subjected to H&E and TUNEL staining to detect the pathological changes and apoptosis in situ.Inflammatory response was determined by quantifying levels of interleukin-1(IL-1),interleukin-6(IL-6),interleukin-18(IL-18),tumor necrosis factor-(TNF-),NOD-like receptor protein 3(NLRP3)or melanoma defic
8、iency factor 2(AIM2)in intestine with enzyme-linked immunosorbent assay.Western blot and immunofluorescence staining were used to detect the expression of NLRP3 and AIM2 in small intestine.To verify the essential role of NLRP3 and AIM3 on radio-protective of DMF on small intestine,the selective agon
9、ists were employed.Results DMF(15 mgkg-1)significantly improved the pathological status of small intestine and decreased the apoptosis level of intestinal cells upon whole body IR exposure.DMF could also significantly inhibit the inflammatory response on small intestine induced IR injury.Western blo
10、t results and tissue immunofluorescence staining showed that DMF could significantly suppress the upregulation of NLRP3 and AIM2.With selective agonists,the radio-protective effect of DMF on small intestine was diminished,indicating the critical role of NLRP3 and AIM2 inflammasome signaling involved
11、 in the anti-radiation activity of DMF.Conclusion DMF is a promising agent to alleviate IR-induced intestinal injury,and the inhibition of NLRP3/AIM2 inflammasome signaling seem to be the underlying mechanism involved in the radio-protective effect of DMF.Keywords:Dimethyl fumarate;radiation injury;
12、inflammasome;intestinal injury;ELISA;IL-1;IL-6;IL-18;TNF-;mice广泛使用,但辐射敏感组织暴露在辐射下所造成的不良影响一直备受关注1。近年来,随着世界核安全形势的紧张以及放射治疗的迅速发展,辐射损伤防护药物研究的重要性逐渐显现。此外,放射治疗作为治疗恶性肿瘤的有效手段,在杀死癌细胞的同时,也会对正常细胞造成一定损伤,寻找一种能够在放中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.184射治疗中最大限度杀死癌细胞的同时、尽可能保护正常细胞的药物,是面临的一大难题。氨磷汀仍然是美国食
13、品药品监督管理局(FDA)批准的唯一用于辐射防护的药物,但其成本高、半衰期短,尤其是基于给药途径的毒性限制了其临床应用2,发现新的辐射防护剂以治疗辐射综合征患者已成为当务之急。富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是富马酸酯类的化合物,具有多种生物活性,包括各种免疫调节和神经保护作用,已被 FDA 批准用于治疗复发-缓解型多发性硬化,近来发现其在多种器官中均表现出抗氧化特性3。但关于 DMF 抗辐射作用目前尚未报道,本研究在 DMF 的辐射防护作用基础上,对 DMF 的辐射防护机制进一步进行研究,从而说明 DMF 在电离辐射中的潜在作用及机制。1 实验材料1.1 实验动物S
14、PF 级 C57BL/6J 雄性小鼠 85只,810 周龄,体质量 2022,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2021-0006。实验过程中对动物的处置严格遵守军事医学研究院实验动物管理与使用委员会的伦理学标准进行(伦理号:IACUC-DWZX-2021-557)。1.2 主要药品与试剂 富马酸二甲酯(MCE 公司,批号:HY-17363,纯度:99.91%);尼日利亚菌素钠盐(MCE 公司,批号:HY-100381,纯度:98.94%);Poly(dAdT)(Invivogen公司,批号:tlrl-patn);白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白
15、介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、NLRP3、AIM2 酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂均购于酶免生物技术有限公司;gamma H2A.X 抗体(abcam公司,批号:ab81299);ASC抗体(Cell Signaling Technology公司,批号:67824);AIM2 抗体(Cell Signaling Technology公司,批号:63660);NLRP3 抗体(成都正能生物技术有限责任公司,批号:381207)。1.3 仪器设备 60Co 射线照射源由军事医学研究院辐射医学研究所提供,单次吸收剂量率为 70.37 cGy min-1;酶标分析仪(美国P
16、erkin Elmer 公司,型号:PE VictorX);荧光显微镜(德国 Leica 公司,型号:LEICA DMi8)。2 实验方法 2.1 动物模型建立与分组 本实验将 85只 C57BL/6J 小鼠分为空白组,辐照组,辐照+DMF(15 mgkg-1)、辐照+尼日利亚菌素钠盐(10 mg kg-1)DMF(15 mg kg-1)给药组、辐照+Poly(dAdT)(50 g kg-1)DMF(15 mg kg-1)给药组,其中空白组、辐照组、辐照+DMF组每组25只,其余组每组5只。DMF给药组小鼠于照射前12 h,照后0.5、12、24、48 h 腹腔注射溶解于注射用油的 DMF(1
17、5 mgkg-1),尼日利亚菌素钠盐和 Poly(dAdT)于照射前 12 h 给药1次,空白组和模型组小鼠腹腔注射等体积注射用油。分别对空白组以外的各组小鼠进行全身60Co 射线照射,剂量率为 70.37 cGymin-1,小鼠置于离照射源 2.5 m 处。2.2 组织病理分析 在照射结束后第1、2、3天分别处死各组小鼠。取出小肠组织,用 4%多聚甲醛固定 24 h,然后用乙醇梯度脱水,石蜡包埋,切成 5 m 切片,切片用苏木精-伊红(H&E)染色,光学显微镜下观察小鼠小肠组织病理学变化。2.3 TUNEL 染色 取石蜡切片,于二甲苯中脱蜡,清洗后滴加100L不含 DNA 的蛋白酶 K 于组
18、织切片上,静置 30 min,再加入 50L TUNEL 溶液于组织切片上,避光静置60 min,终止液反应 15 min,50L converter-POD 滴于组织上,避光静置 30 min,滴加 100L DAB 显色液于组织上,室温反应 10 min 苏木精复染,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,使用荧光显微镜拍照检测样本。2.4 炎症因子检测 照射结束后 72 h,取各组小鼠的小肠组织匀浆。分 别 按 照 IL-1、IL-6、IL-18、TNF-、NLRP3 及AIM2 检测试剂盒说明进行操作。于酶标仪 450 nm波长处测定各孔 OD 值,并计算数值。2.5 蛋白质印迹(We
19、stern blot)分析 取照射后1 d 小肠,用预冷 PBS 洗涤 23 次,剪碎后进行加入裂解液冰上匀浆,制成蛋白上样品。然后定量、电泳、转膜,用 5%脱脂牛奶封闭 2 h,一抗 4孵育过夜。清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育 2 h。转染上蛋白的膜加入 ECL 发光液,采用化学发光法显影。以目的蛋白条带灰度值与 GAPDH 条带灰度值的比值来反映相关蛋白的表达水平,采用 Image J 软件进行灰度值分析。2.6 免疫组织化学染色 组织切片经脱水、透明后,滴加 3%H2O2于组织切片上,阻断内源性过氧化物酶活性,胰蛋白酶进中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1
20、 月 January,2024,Vol.21,No.185行组织抗原修复15 min,3%BSA 室温封闭 20 min,滴加 NLRP3、AIM2 抗体于 4孵育过夜,37复温30 min,PBS 冲洗 3 遍,二抗室温孵育1.5 h,PBS 冲洗 3 遍,经 DAB 显色液显色、苏木精复染、常规脱水透明、中性树胶封片,于荧光显微镜下观察,表达NLRP3 细胞为红色、AIM2 细胞为绿色,并使用软件进行统计分析。2.7 统计学分析 使用 GraphPad Prism 9(GraphPad Software lnc.La Jolla,USA)进行统计分析,每个实验重复 3 次,t 检验统计得出
21、是否具有统计学差异,其中P0.05为统计学意义上的显著差异。3 实验结果3.1 DMF 可以改善辐照后小肠病理状况 为检测 DMF 对辐照后小鼠小肠病理状况的影响,对辐照后第1、2、3 天的组织进行 H&E 染色(图1A),染色结果显示,辐射后第1、2、3 天辐照组小鼠小肠组织结构均发生破坏,小肠绒毛皱缩,隐窝数量明显减少。与辐照组相比,DMF 给药组小鼠小肠绒毛更长(图1B),隐窝深度更深,存活隐窝数量更多(图1C)。3.2 DMF 抑制辐照导致的小鼠小肠细胞凋亡 为验证 DMF 对辐照后小鼠组织细胞凋亡的影响,使用 TUNEL 染色检测小鼠小肠细胞照后1 d 凋亡情况,结果显示对照组小鼠小
22、肠偶见凋亡细胞,辐照组小鼠小肠凋亡细胞明显增多,而给药组小鼠凋亡细胞明显减少,荧光明显减弱(图 2A)。对 3 组凋亡细胞进行统计学分析,结果具有显著性(图 2B)。3.3 DMF 减轻辐照导致的炎症因子升高 为了检测 DMF 对辐照后组织炎症因子水平的影响,于辐照后第 3 天使用 ELISA 试剂盒检测组织内炎症因子及炎性小体水平。结果显示,相比于正常对照组,辐照组小鼠小肠 IL-1、IL-18、TNF-、IL-6、NLRP3 和 AIM2 各有不同程度升高,在提前给予 DMF 处理后,相比于辐照组,给药组均能不同程度调节辐照导致的组织内细胞因子紊乱,其中IL-6(P0.05,图 3B)、I
23、L-1(P0.05,图 3C)、IL-18(P0.05,图3D)、NLRP3(P0.05,图3E),AIM2(P0.05,图 3F)均有不同程度统计学意义,表明 DMF 能够显著调节小鼠辐照导致的小鼠小肠内炎症因子紊乱。3.4 DMF 减轻小鼠小肠 NLRP3/AIM2 炎性小体表达 Western blot 结果显示,辐照后 NLRP3、AIM2等蛋白表达升高,而 DMF 给药组 NLRP3、AIM2 表达水平降低(图 4A、4B)。荧光染色显示与对照组相比,辐照组小鼠小肠 NLRP3/AIM2 表达明显增加;与辐照组相比,DMF 给药组组织内 NLRP3/AIM2 表达明显减少(图 4C、
24、4E),对荧光结果进行统计分析,结果(4D、4F)所示,差异具有统计学意义。注:A.照射后 3 d 小鼠小肠 H&E 染色;B.照射后小鼠小肠隐窝比例统计;C.照射后小鼠小肠绒毛长度统计;与正常组相比,*P 0.01,*P 0.001;与辐照组相比,#P 0.05,#P 0.01,#P 0.001,#P 0.000 1(x-s,n=5)Note:A.Small intestine H&E staining of mice three days after irradiation;B.The proportion of small intestinal crypts in mice after
25、irradiation;C.The length of villi in small intestine of mice after irradiation;compared with the control group,*P 0.01,*P 0.001;compared with the IR group,#P 0.05,#P 0.01,#P 0.001,#P 0.000 1(x-s,n=5)图1 H&E 染色检测 DMF 对辐照后小鼠小肠损伤情况Figure 1 H&E staining to detect DMF damage to the small intestine of irra
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