冬瓜枯萎病菌的分离、鉴定及冬瓜种质抗性鉴定.pdf
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1、中中 国国 瓜瓜 菜菜2024,37(1):64-75试验研究收稿日期:2023-07-04;修回日期:2023-10-19基金项目:东莞市社会科技发展重点项目(20200507101163)作者简介:曾莉莎,女,研究员,研究方向为蔬菜病虫害防控。E-mail:通信作者:陈康丽,女,助理农艺师,研究方向为蔬菜育种及栽培。E-mail:冬瓜(Benincasa hispida Cogn)属葫芦科冬瓜属一年生蔓性草本植物,起源于中国和东印度,在我国已有 2000 多年的栽培历史,主要分布于广东、广西、海南等地区1-2。冬瓜营养丰富,富含多种人体必需营养元素和各种维生素3,加之冬瓜具有易栽培、产量高
2、、耐贮运等优点,已成为近年来各地助力产业振兴的优选蔬菜种类2。然而,随着冬瓜复种指数的提高、资源单一化和种植地区集中化,病害的发生日益突出,尤其是枯萎病,部分冬瓜产区的枯萎病发病率高达 70%,严重的甚至绝收,给冬瓜枯萎病菌的分离、鉴定及冬瓜种质抗性鉴定曾莉莎,陈康丽,杜彩娴,李洪波,苗兵兵,莫伟钦,吕顺(东莞市农业科学研究中心广东东莞523000)摘要:冬瓜在瓜类蔬菜生产中占有重要地位,而枯萎病严重威胁冬瓜的安全生产。通过病原菌致病力测定、形态学特征观察、培养特性比较,以及基于翻译延伸因子(TEF-1)的系统发育分析,对采自广东、广西等地的冬瓜枯萎病病原菌进行鉴定,将引起冬瓜枯萎病的病原鉴定
3、为尖孢镰刀菌冬瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.benincasae)。在此基础上,选取致病力较强的冬瓜枯萎病菌株,以不同冬(节)瓜资源为材料,采用苗期灌根接种法对所收集的 26份小冬瓜资源、47 份节瓜资源和 74 份大冬瓜资源进行抗病性鉴定。结果表明,147 份冬(节)瓜资源的抗性鉴定结果差异相对较大,且不同冬(节)瓜资源间的枯萎病发病率存在显著差异,其中 26 份小冬瓜资源中没有 1 份高抗材料;47 份节瓜资源中有 2 份高抗材料(JG-25 和 JG-33),占比 4.26%;74 份大冬瓜资源中有 4 份高抗材料(DDG-19、DDG-32、DDG-40 和
4、 DDG-74),占比 5.41%。研究结果为抗枯萎病冬瓜种质资源的筛选及瓜类枯萎病抗性遗传育种提供参考。关键词:冬瓜;节瓜;枯萎病;病原菌;抗性鉴定;中图分类号:S642.3文献标志码:A文章编号:1673-2871(2024)01-064-12Isolation and identification of Fusarium wilt pathogen from wax gourdand identification of resistance of wax gourd germplasmZENG Lisha,CHEN Kangli,DU Caixian,LI Hongbo,MIAO Bin
5、gbing,MO Weiqin,L Shun(Dongguan Agricultural Research Centre,Dongguan 523000,Guangdong,China)Abstract:Wax gourd is one of the major vegetable crops in Cucurbitaceae family,and the Fusarium wilt disease seriouslythreatens the safety of wax gourd production.The pathogenicity,morphological characterist
6、ics,and cultural characteristicsof phytopathogen based on translation elongation factor(TEF-1a)through phylogenetic analysis were compared in thisstudy,the Fusarium wilt pathogens of wax gourd collected from Guangdong,Guangxi and other regions were identified,and the pathogen causing Fusarium wilt o
7、f wax gourd was identified as Fusarium oxysporum f.sp.benincasae.On thisbasis,the strong pathogenic ability strains were selected as the inoculum,and using different wax gourd resources as mate-rials,we analyzed the disease resistance of 26 small wax gourd resources,47 chieh-qua resources,and 74 lar
8、ge wax gourdresources by seedling root-irrigation inoculation method.There were relatively significant differences in the disease resis-tance results of 147 wax gourd and chieh-qua resources,and there were significant differences in the incidence of Fusariumwilt among different wax gourd and chieh-q
9、ua resources.None of 26 small wax gourd resources had high resistance toFusarium wilt;two(JG-25 and JG-33)of the 47 Chieh-qua resources showed high resistance,accounting for 4.26%;four(DDG-19,DDG-32,DDG-40,and DDG-74)of the 74 large wax gourd resources showed high resistance,accountingfor 5.41%.This
10、 study provides reference for the selection of resistant germplasm resources of wax gourd and the genet-ic breeding of Fusarium wilt resistance in Cucurbitaceae crops.Key words:Wax gourd;Chieh-qua;Fusarium wilt;Pathogen;Disease resistance identificationDOI:10.16861/ki.zggc.2023.043864第1期,等:冬瓜枯萎病菌的分离
11、、鉴定及冬瓜种质抗性鉴定试验研究农户带来了巨大损失,枯萎病已成为冬瓜可持续健康发展的瓶颈4。葫芦科瓜类枯萎病尖孢镰刀菌共存在 8 个专化型5。尖孢镰刀菌的鉴定主要包括形态学观察、致病性检测和分子生物学鉴定 3 种方法6。一般使用通用引物 ITS1 和 ITS4 扩增分离物鉴定 DNA,将菌株 rDNA-ITS 序列在 GenBank 核酸数据库中进行比对。目前,NCBI 数据库中有大量的镰刀菌 ITS序列,尽管 rDNA-ITS 序列在镰刀菌属不同种间的鉴别能力较强,但不能把菌株与种内的其他专化型菌株区分成不同类群。TEF-1 是目前尖孢镰刀菌系统发育研究中应用最多的基因片段,O Donnel
12、l等7采用 TEF-1 和 IGS 两个基因片段对来源于植物和人类的病原尖孢镰孢菌(F.oxysporum)进行了系统分析,认为 TEF-1 是适用于 Fusarium 群体遗传多样性分析的基因片段,但是目前我国还未见利用 TEF-1 等基因片段对引起瓜类枯萎病的尖孢镰刀菌进行鉴定或系统发育研究的报道。针对冬瓜枯萎病的防治,目前有化学防治、选育抗病资源、嫁接换根、轮作等防治措施8-9,其中以化学防治为主。常见防治冬瓜枯萎病的药剂有恶霉灵、精甲咯菌腈、多菌灵可湿性粉剂等药剂10-11。但化学防治有一定弊端,可以杀死病菌,也会杀死土壤中大量的有益微生物,使土壤的自我修复能力降低,甚至丧失土壤修复能
13、力。化学防治还具有使病菌产生抗药性、蔬菜残留农药和污染土壤环境等副作用。因此,选育抗枯萎病冬瓜(节瓜)品种尤为重要。目前市场上的冬瓜(节瓜)资源大部分以中抗和中低抗枯萎病品种为主,高抗品种较少。康德贤等4采用自然病圃法对 36 份冬瓜种质资源进行抗枯萎病鉴定,结果表明,仅 7 份材料表现高抗,占总数的 19.40%。梁少丽等12采用苗期接种鉴定法对东莞市 16 份冬瓜种质资源进行枯萎病抗性鉴定,结果表明,仅 1 份材料表现高抗,占总数的6.25%。彭家柱等13采用浸根法对 20 份节瓜资源(经多代自交、分离并最终稳定的自交系)进行枯萎病抗性鉴定,结果表明,无材料表现高抗13。谢大森等14采用人
14、工接种法对 84 份冬瓜种质资源进行枯萎病抗性鉴定,结果表明,仅 5 份黑皮冬瓜材料表现高抗,占总数的 5.9%。笔者从广东、广西等冬瓜主栽区采集罹患枯萎病的冬瓜病株,采用组织分离法,从发病植株茎基部上分离病原菌,从病菌的形态学特征、培养特性、TEF-1 序列及致病性等方面进行分析鉴定。然后采用苗期接种法对从华南地区收集的 26 份小冬瓜资源、47 份节瓜资源和 74 份大冬瓜资源进行枯萎病抗性鉴定,筛选出高抗资源,以期为不同抗病性冬瓜资源的合理布局和冬瓜枯萎病的生物生态防治提供理论指导。1材料与方法1.1供试材料试验于 2020 年春秋两季在东莞市农业科学研究中心万江基地实验室对具有典型感病
15、症状的材料进行病原物分离。供试病原菌包括采自广东、广西不同地区具有代表性的 6 个冬瓜枯萎病菌株,其来源及编号见表 1。用 于 致 病 力 测 定 的 冬 瓜 材 料 是 XDG-7、XDG-8,均为稳定的多代自交系,据多年田间观测,田间表现为中低抗枯萎病。待鉴定冬(节)瓜资源:在 2021 年,结合全国冬瓜产业大会,从广东、广西、福建及湖南等冬瓜主产区引进收集了 26 份小冬瓜、47 份节瓜和 74 份大冬瓜资源,共计 147 份资源,大部分为杂交种 F1代,少数为自交多代的稳定自交系。其中 XDG126 是小冬瓜,JG147 是节瓜,DDG174 是大冬瓜。本文中的冬瓜资源为 2021 年
16、全国冬瓜产业大会中面向冬(节)瓜育种研究单位、品种推广部门以及种业销售公司征集的新优冬(节)瓜品种,由广州种子商会征集并提供。1.2病原菌的分离、纯化及形态鉴定采用组织分离法,从发病植株茎基部上分离病原菌,用 2%次氯酸钠消毒 60 s,75%乙醇消毒 3 次,随后用无菌水洗涤,再用灭菌过的吸水纸吸干水表 1供试病原菌株信息Table 1Information of the tested pathogenic strains菌株编号IsolateNLDG-10-1NLDG-10-4NLDG-5-3YLDG-1-2YLDG-2-6DGDG-1-4寄主Host冬瓜(Benincasa hispid
17、a)冬瓜(Benincasa hispida)冬瓜(Benincasa hispida)冬瓜(Benincasa hispida)冬瓜(Benincasa hispida)冬瓜(Benincasa hispida)地理来源Geographic origin广西南宁市(Nanning city,Guangxi)广西南宁市(Nanning city,Guangxi)广西南宁市(Nanning city,Guangxi)广西玉林市(Yulin city,Guangxi)广西玉林市(Yulin city,Guangxi)广东省东莞市(Dongguan city,Guangdong)曾莉莎,等:冬瓜枯萎
18、病菌的分离、鉴定及冬瓜种质抗性鉴定65中国瓜菜第37卷试验研究分,置于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基上 28 培养。待长出菌丝后,挑取部分菌丝接种在 PDA 平板上,经 3 次纯化后,采用稀释法进行单孢分离和培养,观察其生长性状,在显微镜条件下观察气生菌丝上小型分生孢子的着生状态、大小、形状,分生孢子座上的大孢子以及厚垣孢子的形态。据柯赫氏法则将菌株回接冬瓜幼苗上,接种 18 株,3 次重复,无菌水为对照。对发病冬瓜幼苗进行病原物的再分离,与原接种菌株比较,进行柯赫氏法则验证。1.3致病菌的TEF-1序列分析采用 CATB 法进行菌体基因组 DNA
19、的提取。用镰刀菌(Fusarium)种类鉴定通用引物翻译延伸因子(TEF-1)扩增病原菌基因组总 DNA。引物序列为 EF1H(ATGGGTAAGGAAGACAAGAC)和EF2T(GGAAGTACCAGTGATCATGTT)。使 用MEGA version 7.0 构建系统发育树,进化距离分析采用邻位相连法(neighbor-joining,NJ),用 Boot-strap 1000 次重复进行系统树的检验。将菌株TEF-1 序 列 在 GenBank 核 酸 数 据 库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)及 FusariumMLST database(htt
20、ps:/fusarium.mycobank.org/)中进行 BLASTN 比对和同源性分析。1.4育苗冬(节)瓜种子播种前用温汤浸种 6 h,然后置于 28 条件下催芽,23 d 后播于灭过菌的穴盘中。待幼苗长出真叶后,用于苗期人工接种。1.5冬瓜枯萎病菌孢子悬浮液的制备选取致病力强且生长旺盛的冬瓜枯萎病菌丝接种于液体培养基中,于 28 条件下震荡培养 35 d。将培养液用双层纱布过滤去掉菌丝,滤液离心后,去除上清液。用血球计数器计算病菌孢子的浓度,小孢子接种浓度为 1106个 mL-1。1.6苗期人工接种枯萎病鉴定与病情分级标准选取长势健壮、大小基本一致、株高为 1015 cm的冬(节)瓜
21、实生苗用栽培基质种植于盆钵中,7 d后用 1106个 mL-1的冬瓜枯萎病菌孢子悬浮液伤根浇灌接种(浇灌前在距根际 1 cm 的 4 个方向各切一刀),每株浇灌 10 mL,以清水处理为对照,每个处理组分别接种 30 株瓜苗15-16。接种温度 2225,用无色塑料膜保湿 24 h,保湿后的植株置于白天 25 左右、夜晚 18 左右的温室内正常管理。接种 7 d 后开始调查发病情况,统计并记录147 份冬(节)瓜资源枯萎病发病率,采用 SPSS 23.0进行统计和差异显著性分析。参照康德贤等4的方法进行抗性分级,将冬瓜资源对枯萎病的抗性分为 4 个等级:高抗(HR),枯萎病发病率低于 20%;
22、中抗(MR),枯萎病发病率21%50%;轻抗(LR),枯萎病发病率 51%80%;感病(S),枯萎病发病率 81%100%。采用 SPSS 23.0对数据进行统计和差异显著性分析。2结果与分析2.1冬瓜枯萎病菌的分离与纯化将分离纯化后的菌株接种于 PDA 平板内,28 培养 3 d 后,肉眼观察菌落形态,发现其菌丝致密絮状,白色至淡紫色。显微镜下观测其小型分生孢子呈长椭圆形、纺锤形、直或略弯曲成肾形等,假头生,大型分生孢子呈镰刀形,多为 35 分隔。厚垣孢子较易形成,数量多,球形或亚球形。以上形态学特征符合尖孢镰孢菌(F.oxysporum)的形态描述(图 1)。2.2分离的枯萎病菌致病性鉴定
23、将分离得到的尖孢镰刀菌孢子悬浮液接种于冬瓜幼苗上,结果表明,该菌株对冬瓜具有强致病性。冬瓜幼苗于接种 7 d 时,开始出现轻微萎蔫症状;接种 10 d 左右,植株大部分叶片出现萎蔫症状;接种 20 d 后,植株表现为黄叶、萎蔫甚至死亡症状;病害后期常能看到藤蔓中下部至茎基部出现红褐色纵裂条纹,在潮湿条件下表皮腐烂,剖开病株可发现其维管束变成褐色;但清水处理(CK)的植株正常生长,无萎蔫症状(图 2)。重新分离接种的病原菌再回接到健康的冬瓜植株上,均获得与接种时相同的病原物;清水对照(CK)未分离到病原物。2.3TEF-1序列测定从 GenBank 数据库中下载 27 株镰刀菌菌株的TEF-1
24、序列,与供试菌株的 TEF-1 序列采用MEGA 7.0 软件进行一致性比对,构建系统发育树。从 图 3 可 以 看 出,6 个 冬 瓜 枯 萎 病 菌 株NLDG-10-1、NLDG-10-4、NLDG-5-3、YLDG-1-2、YLDG-2-6 和 DGDG-1-4 与尖孢镰刀菌不同专化型聚在一起(支持率为 99%),且与引起葫芦科瓜类枯萎病的尖孢镰刀菌西瓜专化型 F.oxyspoorum f.sp.niveum、尖孢镰刀菌黄瓜专化型 F.oxyspoorum f.sp.cucumerinum、尖孢镰刀菌甜瓜专化型 F.oxy-spoorum f.sp.melonis 和尖孢镰刀菌瓜类专化
25、型 F.oxyspoorum f.sp.cucurbitacearum 亲缘关系最近,进一步支持了分离致病菌为尖孢镰刀菌冬瓜专化型66第1期,等:冬瓜枯萎病菌的分离、鉴定及冬瓜种质抗性鉴定试验研究注:A.PDA 平板上的菌落形态;B.小型分生孢子;C.厚垣孢子;D.大型分生孢子;E.产孢梗;标尺=10 m。Note:A.Colony morphology on potato dextrose agar;B.Microconidia;C.Chlamydospore;D.Macroconidia;E.Sporophore;Bars=10 m.图 1冬瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum
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