大别班达病毒的遗传进化机制研究.pdf

,()中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e sD O I:/j i s s n 基础理论与方法大别班达病毒的遗传进化机制研究张宇涵,李超,王玉昊,韦雪敏,许一菲,山东省优秀青年科学基金项目(海外)(N o HWYQ )和江苏省自然科学青年基金(N o B K )联合资助通讯作者:许一菲,y i f e i x u s d u e d u c n;O R C I D:作者单位:山东大学齐鲁医学院公共卫生学院微生物检验学系,济南 ;山东大学苏州研究院,苏州 摘要:目的阐明大别班达病毒(D a b i eb a n d a v i r u s,D B V)的基因型流行分布特征,探究D B V进化机制的动态变化,为D B V的预防控制提供科学依据.方法使用I q t r e e软件以最大似然法构建D B V的L、M、S片段系统发育进化树并进行遗传进化关系的分析;以系统发育进化树为参考,筛选重配株;使用R D P 软件进行D B V重组情况的检测;D B V序列的遗传距离以及选择压力分析由M e g a 软件计算.结果重组分析显示共 株毒株出现重组现象,潜在重组事件共计 个.L、M、S片段的重组率分别为、.重组事件在非人类宿主中检测到的比例相较之前的研究有所上升.经重配分析,在 株重配株中发现了 种重配基因型,未报道过的重配基因型有 种.本研究检测到 株同时发生重组和重配的基因组序列.d N/d S的结果表明,R NA依赖的R NA聚合酶(R d R p)、糖蛋白(G P)、核蛋白(N P)和非结构蛋白(N S s)进化过程中可能主要受负选择压力影响.结论越来越多的动物宿主如狗、猫、牛等参与D B V的重组、重配事件中,使其进化机制更趋复杂,这对D B V疫苗的设计和S F T S的预防带来了更大的挑战.关键词:D B V;重组;重配;选择压力;进化中图分类号:R 文献标识码:A文章编号:()I n v e s t i g a t i o no f t h eg e n e t i ce v o l u t i o n a r ym e c h a n i s m so fD a b i eb a n d a v i r u sZ HANGY u h a n,L IC h a o,WANGY u h a o,WE IX u e m i n,XUY i f e i,(D e p a r t m e n t o fM i c r o b i o l o g y,S c h o o l o fP u b l i cH e a l t h,C h e e l o oC o l l e g eo fM e d i c i n e,S h a n d o n gU n i v e r s i t y,J i n a n ,C h i n a;S u z h o uR e s e a r c hI n s t i t u t eo fS h a n d o n gU n i v e r s i t y,S u z h o u ,C h i n a)A b s t r a c t:T h ep u r p o s eo f t h i s s t u d yw a s t oe l u c i d a t e t h eg e n o t y p ee p i d e m i cd i s t r i b u t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fD a b i eb a n d a v i r u s(D B V)a n ds t u d y t h ec h a n g e s i nm e c h a n i s m so fD B Ve v o l u t i o n,t op r o v i d eas c i e n t i f i cb a s i s f o rd i s e a s ep r e v e n t i o na n dc o n t r o l D B Vp h y l o g e n e t i c t r e e sw e r ec o n s t r u c t e dw i t hI q t r e e R e c o m b i n a t i o ne v e n t sw e r ed e t e c t e dw i t hR e c o m b i n a t i o nD e t e c t i o nP r o g r a mv (R D P),a n dr e a s s o r t a n t sw e r e s c r e e n e da c c o r d i n g t o t h ep h y l o g e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e G e n e t i cd i s t a n c e s a n ds e l e c t i o np r e s s u r ea n a l y s i so fD B Vs e q u e n c e sw e r ec a l c u l a t e d i nM e g a s o f t w a r e At o t a l o f p o t e n t i a l r e c o m b i n a t i o ne v e n t si n s t r a i n sw e r ed e t e c t e d T h er e c o m b i n a t i o nr a t e so f t h eL,M,a n dSf r a g m e n t sw e r e,a n d,r e s p e c t i v e l y T h ep r o p o r t i o no f r e c o m b i n a t i o ne v e n t sd e t e c t e d i nn o n h u m a nh o s t sw a sg r e a t e r t h a no b s e r v e d i np r e v i o u ss t u d i e s At o t a l o f r e a s s o r t m e n t f o r m s i n r e a s s o r t a n t sw e r e i d e n t i f i e d,a n d s e q u e n c e sw i t hs i m u l t a n e o u s r e c o m b i n a t i o na n dr e a r r a n g e m e n tw e r ed i s c o v e r e d T h ed N/d Sr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tn e g a t i v e s e l e c t i o np r e s s u r em i g h tb e t h em a i ns e l e c t i o np r e s s u r eo nt h eL,M,a n dSs e g m e n t s T h ee v o l u t i o n a r ym e c h a n i s mo fD B Vi sc o m p l i c a t e d,b e c a u s ea ni n c r e a s i n gn u m b e ro fa n i m a lh o s t sa r e i n v o l v e d i n i t sr e c o m b i n a t i o na n dr e a s s o r t m e n t e v e n t s,t h u sp o s i n gc h a l l e n g e s i nt h ed e s i g no fD B Vv a c c i n e sa n dt h ep r e v e n t i o no fS F T S K e y w o r d s:D a b i eb a n d a v i r u s(D B V);r e c o m b i n a t i o n;r e a s s o r t m e n t;s e l e c t i o np r e s s u r e;e v o l u t i o nS u p p o r t e db yS h a n d o n gE x c e l l e n tY o u n gS c i e n t i s t sF u n dP r o g r a m(O v e r s e a s)(N o HWYQ );N a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no f J i a n g s uP r o v i n c e(N o B K )C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:X uY i f e i,E m a i l:y i f e i x us d u e d u c n大别班达病毒(D a b i eb a n d a v i r u s,D B V)是一种新型的布尼亚病毒,年由于学杰等人在中国首次发现并分离鉴定.D B V主要通过蜱虫叮咬传 播 给 人 类,引 起 发 热 伴 血 小 板 减 少 综 合 征(S F T S),临床表现为高热、血小板和白细胞计数减少等症状,并伴有中枢神经症状、胃肠道症状等.S F T S的地方性散发流行期为 月.年,S F T S年平均病死率为.S F T S在中国主要流行于河南、湖北、山东、浙江、辽宁等省份 .D B V属 于B u n y a v i r a l e s目,P h e n u i v i r i d a e科,B a n d a v i r u s属.D B V是 单 股 负 链 分 节 段 的R NA病毒,包含L、M、S个片段,分别编码R NA依赖的R NA聚合酶(R d R p)、糖蛋白(G p)、非结构蛋白(N S s)和核蛋白(N P).参与病毒的复制与转录的L基因编码的R d R p蛋白,是最保守的蛋白,进化速率也较慢;S基因编码的N S s蛋白主要参与宿主的免疫调节,其系统发育最为多样,是保守性最低的蛋白,进化速率也较快.可根据地理位置和系统发育关系,将D B V划分为主要包括中国毒株的中国谱系(C C),主要包括日本和韩国毒株的日本谱系(J J),.此外,两个潜在的亚谱系C 和J 在 年的一项研究中得到了鉴定.此前有研究表明,虽然中国和日本地区的D B V毒株可能源自同一祖先,但他们的亲缘关系较远,这暗示着很早以前,两个地区的毒株就已开始各自独立进化.重配是分节段病毒特有的遗传进化事件,当多株不同型别的病毒感染同一宿主时,其R NA片段会进行混合,从而产生新特性的病毒.重组和重配事件会对病毒的传播力和致病性产生影响,是病毒进化的潜在动力,.选择压力指的是外界环境在生物进化过程中对其进化方向产生影响的作用力.病毒的进化选择压力来自于宿主的免疫压力和生态环境的变化.病毒容易通过自身的突变来逃避宿主免疫压力或适应新的环境,继而发生适应性变化,导致免疫防治或者药物治疗效果不佳.本研究对截至 年月已发布的数据库全部的D B V各片段全长基因序列进行系统发育分析、基因重组和重配分析以及选择压力分析,阐明D B V的基因型流行分布特征,探究D B V进化机制的动态变化,为D B V的预防控制提供科学依据.材料与方法数据来源在V I P R数据库和G e n B a n k数据库下载D B V全长序列(下载于 年月),并记录序列分离时间、地点,以及样本类型.其中,L片段序列 条,M片段序列 条,S片段序列 条,构 建 以 上个 数 据 集.在R e f s e q(h t t p s:/www n c b i n l m n i h g o v/r e f s e q/)下 载 毒 株H B 为参考株(基因序列登录号:N C_ ).方法系统发育分析对个数据集的序列分别进行系统发育分析.使用MA F F T软件进行多序列比对,使用I q t r e e软件以最大似然法分别构建基于L、M、S片 段 的 系 统 发 育 树(b o o t s t r aP ),并利用R软件包g g t r e e对获得的最大似然树进行可视化和修饰.重组和重配分析本研究运用R D P(R e c o m b i n a t i o nD e t e c t i o nP r o g r a m)软件对提及的个数据集包含的所有序列中的重组事件进行检测.经R D P 内 置 的种 算 法(R D P、B o o t s c a n、h i m a e r a、S e q、G E N E C ONV、L a r d、S i S c a n)检测,序列被种以上方法检测为重组阳性且P 时,即被认为是潜在重组事件.基于L、M、S个片段的系统发育分析结果,在含有D B V全长基因组的 株毒株中,筛选含有不同基因型的节段的潜在重配毒株.选择压力分析使用B i o e d i t进行L、M、S片段的核苷酸和氨基酸同源性分析,使用M e g a 软件的P a i r w i s ed i s t a n c e功能,选择p d i s t a n c e模型,分别计算个片段的遗传距离区间.使用M e g a 软件的N e i G o j o b o r im e t h o d(N o o fD i f f e r e n c e s)模型分别计算L、M、S个片段的d N和d S的值.当d N/d S时,认为发生正向选择作用;当d N/d S 时,认为发生负向选择作用.结果D B V系统发育分析L、M、S个片段的进化树结果显示,D B V可分为种基因型别:C C 和J J.L、M片段比S片段多出C 型.个片段中属于C、C 型的序列数量最多,C、C 型涵盖的地域范围最广,J、J 型包含的宿主类型最丰富.中国的D B V序列主要分布在C谱系,其中河南省和湖北省的优势基因型是C,其次是C 型,山东省的优势基因型为C 型.日本、韩国的D B V序列以J谱系为主,且优势基因型均为J 型.同时,J 型的浙江部分毒株和日本毒株在同一个支系,J 型的河南部分毒株和韩国毒株在同一支系.中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()注:A B C分别代表系统发育进化树的L、M、S片段.图D B V系统发育进化树F i g P h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fD B Vs t r a i n sD B V重组和重配结果经R D P 软件筛选后,在本研究数据集中发现 株毒株中存在 个潜在重组事件(表),L、M、S片段分别发现、个重组事 件.其 中,L片 段 的 重 组 率 最 高,为(/),M片段的重组率为(/),S片段重组率最低,为(/).毒株 Y X X 的个片段均发生了重组,另有 株毒株的两个片段发生了重组,如毒株 C h i n a_H e n a n 、毒 株HN X Y_、毒 株N B /CHN/等.此外,在 株毒株中发现了存在多次重组 事 件 的 节 段,例 如 毒 株 Y S C 、毒 株H B 、毒株 Y X X 等.上述结果表明L片段发生重组的概率较高,S片段发生重组的概率较低.人类样本发生重组事件的数量较多(/),蜱虫和家畜样本较少(/).L、M、S片段中,人类宿主 检 测 到 重 组 的 概 率 分 别 为、,动物(蜱虫和家畜)宿主检测到重组的概率分别为、.在非人类宿主中检测到重组事件的比例高于人类宿主,且相较之前的研究(各片段均)有所增加.根据L、M、S三个片段的系统发育分析结果,在 株重配株中发现了 种重配基因型(图),其中 种类型已被先前的研究报道过 .主要的重配类型为C C C(/)、J J J(/)和C C C(/).绝大部分重配毒株发现于人源样本(/),有株来源于家畜(/)、蜱虫(/)和小型哺乳动物(/),此外还有株来源于实验室宿主.同时,大部分动物宿主来源的重配株均来自日本(/).同时,我们发现 株同时发生重组和重配的毒株(表).其中有两株毒株(S F T S V/D o g/T h a i l a n d/、T N B )分离自动物宿主.期张宇涵,等:大别班达病毒的遗传进化机制研究表D B V发生重组的毒株统计T a b D B Vr e c o m b i n a t i o ne v e n t sd e t e c t e dw i t ht h eR D P p a c k a g e毒株基因片段基因型宿主地域 Y S C LbC C C H u m a nH e n a nH B LbC H u m a nH u b e i C h i n a_H e n a n L&MaC H u m a nC h i n a Y X X Lb&M&SaC H u m a nH e n a nHN X Y_ L&Ma,bC H u m a nH e n a nN B /CHN/L&Ma,bC C J H u m a nC h i n aS D L&MaC H u m a nS h a n d o n gAH Z/L&MaC H u m a nC h i n aS D LbC H u m a nS h a n d o n g K S L&MaJ J J H u m a nS o u t hK o r e aH B HG /H u a n g g a n g_Q i c h u n/LbJ H u m a nC h i n aJ S L&MaJ J J H u m a nC h i n aS D L&SaC H u m a nS h a n d o n gS D t i c k S F T S LC T i c kS h a n d o n g C h i n a_H e n a n LC H u m a nH e n a n K S LJ J J H u m a nS o u t hK o r e a K S LJ H u m a nS o u t hK o r e a C h i n a_H e n a n LC C C H u m a nH e n a nJ S LC H u m a nC h i n a C h i n a_H e n a n LC H u m a nH e n a n C h i n a_H u b e i LC H u m a nH u b e i C h i n a_H e n a n LC H u m a nH e n a n C h i n a_H e n a n LC H u m a nH e n a nH B LJ J J H u m a nH u b e iH B LC C C L a bh o s tH u b e i C h i n a_H 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a C h i n a_H u b e i SC H u m a nH u b e i期张宇涵,等:大别班达病毒的遗传进化机制研究表(续)毒株基因片段基因型宿主地域 C h i n a_H u b e i SC H u m a nC h i n aA FMC SJ H u m a nS o u t hK o r e aS D SC H u m a nS h a n d o n g SSC H u m a nH e n a nZ J Z H S H HY C/C h i n a/SJ H u m a nC h i n a M S SJ J J H u m a nS o u t hK o r e a C h i n a_H e n a n SC H u m a nC h i n a注:a表示重组事件同时发生在一株毒株的多个片段;b表示一个片段发生多个重组事件.图D B V 种重配株的组合图F i g G e n e t i cc o n s t e l l a t i o no f t h e p o t e n t i a lD B Vr e a s s o r t a n t sD B V基因同源性及遗传距离分析D B V毒株间表现出较高的同源性,L、M、S片段的核苷酸同源性分别为 ,;R d R p基因、G p基因、N S基因、N P基因的氨基酸同源性分别为 ,(表).D B V个基因的总体遗传距离分别为 、和 ,L片段的遗传距离区间为 ,M片段的遗传距离区间为 ,S片段的遗传距离区间为 (表).结果表明S片段的核苷酸和氨基酸同源性均低于L、M片段,与其他两者相比,遗传距离也较大.表D B V基因核苷酸和氨基酸同源性结果T a b D B Vg e n en u c l e o t i d ea n da m i n oa c i ds e q u e n c e i d e n t i t yLMSN S sN P核苷 酸 同 源性()氨基 酸 同 源性()中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()表D B V毒株遗传进化距离分析结果T a b G e n e t i ce v o l u t i o n a r yd i s t a n c eo fD B Vs t r a i n s基因遗传距离区间平均遗传距离L M S D B V选择压力分析通过M e g a 软件对D B V编码的个蛋白进行了全局d N/d S分析(如表所示),结果显示,个蛋白的d N/d S值均小于,表明在进化过程中,个蛋白均受到负选择压力的作用.而与L基因、M基因和N P蛋白相比,N S蛋白的d N/d S值最高为.表D B V蛋白的d N/d S比值结果T a b G e n e s d N/d Sr a t i o sd e t e r m i n e dw i t hME G A m e t h o d蛋白d N/d SR d R p G n、G c N P N S s 讨论由D B V感染引发的S F T S是我国目前急需解决的公共卫生问题,它是一种易诱发多种临床病症且病死率较高的蜱媒传染病,目前尚无获得临床批准的S F T S特效抗病毒药物,支持治疗是S F T S患者的主要 临 床 治 疗 方 式 .自 最 初 发 现 以 来,D B V已在中国、日本、韩国 等超过 个国家被发现,在美国 和澳大利亚 也相继发现了一些新白蛉病毒与D B V存在着密 切进化关 系.年,D B V被世界卫生组织(WHO)列为十大最受关注的病原之一.该研究通过测定公共数据库的全部D B V基因组序列,对D B V的遗传进化从全序角度进行了深入系统的研究.本研究验证了绝大多数D B V型别的分布具有地域性,在D B V的两大谱系中,C谱系主要包括中国毒株,J谱系主要包括韩国和日本毒株.小部分毒株的基因型存在跨地域分布,Y u nY等将中日韩间的D B V基因型分布与候鸟迁徙路线结合分析,认为候鸟可能在D B V的跨地域传播中发挥着重要作用,.本研究进一步证实了先前研究报道过的重组情况 ,并在人类宿主与动物宿主分离出的D B V毒株中均发现重组的现象,且动物宿主的重组率高于人类宿主.大部分重组D B V毒株是来自人源样本,而小部分动物宿主来源的毒株也作为亲本序列促进或参与了重组的发生,说明动物宿主也提供了进行重组的场所.在蜱虫、狗、猫、刺猬等不同动物宿主来源的毒株中都发现D B V重组现象,并且近年来动物宿主发生重组的比例在增加,这表明D B V可以发生广泛的跨物种传播和感染.本研究发现了 种未被报道过的重配型别,提示D B V的毒力和流行传播能力正在发生改变,此发现对疾病的控制具有重要意义.重配事件所涉及的不同的地域,表明D B V可能在不同的地域之间进行迁移.蜱虫曾被认为可能是适合D B V重配株的来源,本研究中重配株的宿主多样性提示,除蜱虫外,家畜或伴侣动物也可能会加强D B V重配现象的产生.越来越多的动物宿主如狗、猫、牛等参与D B V的重组、重配事件中,使其进化机制的丰富度不断提高,这对D B V疫苗的设计和S F T S的预防产生了更大的挑战.基因组全编码区的选择压力分析对其疫苗和药物的开发具有较大的指导意义.本研究结果表明影响D B V进化的主要选择压力是负选择压力,这一结论与以往的研究一致.个基因的d N/d S值均小于,其中N S基因的d N/d S值高于其他个基因,这可能与N S基因编码的蛋白有关.N S s能够通过拮抗干扰素而影响毒力,进而帮助病毒逃避宿主的抗 病 毒 反 应,从 而 参 与 宿 主 的 免 疫 调 节.N S s为保守性最低的蛋白,其进化速率也较快.相比于其他两个片段,N S基因较低的同源性和较远的平均遗传距离进一步验证了N S s基因片段具有较高突变能力.由于蛋白中的氨基酸变化可能影响其功能,进而影响D B V的感染性和致病力,基因型特异性的突变位点是否存在还需要进一步被探索.利益冲突:无引用本文格式:张宇涵,李超,王玉昊,等大别班达病毒的遗传进化机制研究J中国人兽共患病学报,():D O I:/j i s s n 参考文献Y uX J,L i a n gMF,Z h a n gS Y,e ta l F e v e rw i t ht h r o m b o c y t o p e n i aa s s o c i a t e d w i t han o v e lb u n y a v i r u si nC h i n aJ N e wE n g l JM e d,():D O I:/N E J M o a 陈秋兰,朱曼桐,陈宁,等 年全国发热伴血小板减少综合征流行特征分析J中华流行病学杂志,():D O I:/c m a j c n 期张宇涵,等:大别班达病毒的遗传进化机制研究Z h a nJ,W a n gQ,C h e n gJ,e t a l C u r r e n t s t a t u so f s e v e r e f e v e rw i t ht h r o m b o c y t o p e n i a s y n d r o m e i nC h i n aJ V i r o l S i n,():D O I:/s S u nJ,L uL,W uH,e t a l T h e c h a n g i n ge p i d e m i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fs e v e r ef e v e rw i t ht h r o m b o c y t o p e n i as y n d r o m ei nC h i n a,J S c iR e p,():D O I:/s W uY,Z h uY,G a oF,e ta l S t r u c t u r e so fp h l e b o v i r u sg l y c o p r o t e i nG na n di d e n t i f i c a t i o no fan e u t r a l i z i n ga n t i b o d ye p i t o p eJ PN a t lA c a dS c i,():E E D O I:/p n a s W uX,L iM,Z h a n gY,e t a l N o v e l S F T S Vp h y l o g e n yr e v e a l sn e wr e a s s o r t m e n te v e n t sa n dm i g r a t i o nr o u t e sJ V i r o lS i n,:D O I:/s S h i J,H uS,L i uX,e t a l M i g r a t i o n,r e c o m b i n a t i o n,a n d r e a s s o r t m e n ta r ei n v o l v e di nt h ee v o l u t i o no fs e v e r ef e v e r w i t ht h r o m b o c y t o p e n i as y n d r o m eb u n y a v i r u sJ I n f e c tG e n e tE v o l,:D O I:/j m e e g i d Y o s h i k a w aT,S h i m o j i m a M,F u k u s h iS,e ta l P h y l o g e n e t i ca n dg e o g r a p h i c r e l a t i o n s h i p so f s e v e r e f e v e rw i t ht h r o m b o c y t o p e n i as y n d r o m ev i r u s i nC h i n a,S o u t hK o r e a,a n dJ a p a nJ JI n f e c tD i s,():D O I:/i n f d i s/j i v L vQ,Z h a n gH,T i a nL,e ta l N o v e ls u b l i n e a g e s,r e c o m b i n a n t sa n dr e a s s o r t a n t so fs e v e r ef e v e rw i t ht h r o m b o c y t o p e n i as y n d r o m ev i r u sJ T i c k sT i c k b o r n eD i s,():D O I /j t t b d i s G e r r a r dS R,L iL,B a r r e t tA D,e t a l N g a r i v i r u s i s ab u n y a m w e r av i r u sr e a s s o r t a n tt h a tc a nb ea s s o c i a t e d w i t hl a r g eo u t b r e a k so fh e m o r r h a g i cf e v e ri n A f r i c aJ JV i r o l,():D O I:/j v i N g u y e nL T,S c h m i d tHA,V o nH a e s e l e rA,e ta l I Q T R E E:af a s ta n de f f e c t i v es t o c h a s t i ca l g o r i t h mf o re s t i m a t i n g m a x i m u m l i k e l i h o o dp h y l o g e n