不同诱导剂和诱导方法对西瓜单倍体染色体加倍效果的比较研究.pdf

中中 国国 瓜瓜 菜菜2024，37（1）：25-31试验研究收稿日期：2023-08-31；修回日期：2023-11-09基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS-25）；河南省科技攻关项目（232102110223）；河南省农业科学院自主创新资助项目（2023ZC033）；河南省重大科技专项（221100110400）作者简介：李海伦，女，助理研究员，主要从事园艺作物生物技术研究。E-mail：通信作者：赵卫星，男，副研究员，主要从事西瓜甜瓜遗传育种与栽培生理生态研究。E-mail：西瓜是世界十大水果之一，具有甘甜多汁、清爽解渴的特点，夏季广受消费者的喜爱，使其市场需求量大大增加。西瓜栽培周期短、上市快且经济效益高，已经成为广大农民致富的重要产业1。目前优异西瓜品种更新滞后，加上西瓜遗传基础狭窄，常规育种周期长，现有品种已不能满足市场需不同诱导剂和诱导方法对西瓜单倍体染色体加倍效果的比较研究李海伦，高宁宁，李晓慧，康利允，常高正，王琰，王慧颖，赵卫星（河南省农业科学院园艺研究所郑州450002）摘要：为探究不同诱导剂和诱导方法对西瓜单倍体染色体加倍的效果，以西瓜花药离体培养获得的单倍体植株为材料，利用不同质量浓度的秋水仙素和氟乐灵进行培养基加倍、浸芽加倍、滴生长点加倍 3 种方法研究单倍体植株诱导二倍体植株的效果。结果表明，不同加倍方法对单倍体加倍的诱导率存在很大差异。秋水仙素诱导加倍，植株的存活率均达到 100%，氟乐灵诱导加倍，加倍植株的致死率最高达到 100%。组培法诱导加倍时，秋水仙素和氟乐灵均在质量浓度为 60 mgL-1时，加倍诱导率最高，分别是 50.00%和 41.67%。浸芽法诱导加倍时，600 mgL-1秋水仙素浸芽 4 h 加倍诱导率最高为 75.00%；300 mgL-1氟乐灵浸芽 2 h 加倍诱导率最高为 50.00%。滴生长点诱导加倍时，600 mgL-1秋水仙素诱导的加倍率最高为 50.00%；500 mgL-1氟乐灵诱导加倍率最高为 27.78%。因此，秋水仙素诱导西瓜单倍体植株加倍效果优于氟乐灵，且浸芽法诱导加倍效果最佳。关键词：西瓜；单倍体；秋水仙素；氟乐灵；染色体加倍中图分类号：S651文献标志码：A文章编号：1673-2871（2024）01-025-07Comparative study on chromosome doubling effect of watermelon hap-loid with different inducers and induction methodsLI Hailun,GAO Ningning,LI Xiaohui,KANG Liyun,CHANG Gaozheng,WANG Yan,WANG Huiy-ing,ZHAO Weixing（Institute of Horticulture,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,Henan,China）Asbtract:In order to investigate the effect of different inducers and induction methods on chromosome doubling of water-melon haploid,the haploid plants obtained from watermelon anther culture in vitro were used as materials.Different con-centrations of colchicine and fluralin were used to study the effect of inducing diploid plants from haploid plants by threemethods:medium doubling method,germination doubling method and droplet growing point doubling method.Theresults showed that the induction rate of haploid doubling by different doubling methods varied.The survival rate ofplants induced by colchicine doubling reached 100%,and the mortality rate of plants induced by fluralin doubling reached100%.When induced by tissue culture,the doubling induction rates of colchicine and trifluralin were the highest at amass concentration of 60 mg L-1,with 50.00%and 41.67%,respectively.When inducing doubling by soaking thebuds with 600 mgL-1colchicine for 4 hours,the highest doubling induction rate was 75.00%;the highest doubling induc-tion rate of 300 mgL-1fluralin soaking buds for 2 hours was 50.00%.When inducing doubling at the droplet growthpoint,the highest doubling rate induced by 600 mgL-1colchicine was 50.00%;the highest induction doubling rate of 500mgL-1trifluralin was 27.78%.Therefore,the effect of inducing haploid watermelon plants to double with colchicine isbetter than that with trifluralin,and the soaking method has the best effect on inducing doubling.Key words:Watermelon;Haploid;Colchicine;Fluralin;Chromosome doublingDOI：10.16861/ki.zggc.2023.056525中国瓜菜第37卷试验研究求，所以扩宽西瓜遗传基础，发掘优异种质，提高西瓜品种改良效率是西瓜育种的首要任务。单倍体育种是一条缩短育种年限、加快育种进程的有效途径。花粉辐射2、花药培养3-4、大孢子培养5-6等都是较为常用的单倍体诱导技术。从 20 世纪 80 年代初期起，薛光荣等7-8、袁万良等9、魏瑛10、李娟等11、缑艳霞等12、朱迎春等13研究者就不断地探究西瓜花药离体培养技术，且获得了单倍体植株。单倍体植株需要通过加倍才能用于育种材料和新种质的创制，常用的诱导单倍体加倍的方法有浸芽、浸种、浸根、浸苗、滴生长点和组培法等14-18，常采用的诱导剂有秋水仙素、氟乐灵、炔苯酰草胺和氨磺灵等，及辅助添加剂二甲基亚砜（DMSO）、吐温等，有助于提高加倍效率。高宁宁等14研究表明，辅助添加剂DMSO 可以提高甜瓜单倍体的加倍率。适量的诱导剂配合适宜的加倍方法，将有效地提高加倍率。玉米19、黄瓜20、萝卜21、南瓜22等作物在不同诱导剂和不同方法的诱导下，均得到很好的加倍效果。目前对西瓜单倍体加倍技术的研究较少，还未见成熟的西瓜单倍体加倍技术的报道。笔者总结了前人研究成功的经验，利用秋水仙素和氟乐灵诱导剂，采用组培法、浸芽法、滴生长点法 3 种方法对利用西瓜花药离体培养获得的单倍体植株进行加倍，以期建立高效的西瓜单倍体加倍体系，以便快速、高效地获得纯合的自交系优异种质材料，缩短育种年限，加快西瓜优异新品种的选育进程。1材料与方法1.1材料试验材料为小果型西瓜斯维特。试验于 2022年 59 月在河南省农业科学院园艺研究所组培分子实验室进行，利用西瓜花药离体培养获得的单倍体植株进行扩繁，然后挑选长势一致的扩繁苗来研究不同诱导剂对西瓜单倍体植株加倍的效果。试验材料由河南省农业科学院园艺研究所西甜瓜研究室提供。1.2方法1.2.1西瓜单倍体植株扩繁把西瓜花药离体培养获得的单倍体植株接入芽增殖培养基 MS+0.15 mgL-1KT+10%椰汁+30 gL-1蔗糖+6 gL-1琼脂（pH 5.805.85）中，放入每天光照时间 16 h、光照度 30004000 lx、温度在（252）的培养间中进行增殖扩繁培养，用于快速获得大量的单倍体植株，为研究不同诱导剂对西瓜单倍体加倍的效果提供充足的试验材料。1.2.2培 养 基 添 加 法 诱 导以 培 养 基 MS+0.15 mgL-1KT+10%椰汁为基础培养基，在基础培养基中分别添加不同质量浓度的秋水仙素（0、40、60、80、100 mgL-1）和不同质量浓度的氟乐灵（0、40、60、80、100 mgL-1）配制成加倍培养基，然后将扩繁的单倍体植株接入加倍培养基中，再在上述培养条件下培养 21 d，之后转接到基础培养基中做植株的倍性鉴定。试验共 9 个处理，每个处理接入 4株西瓜单倍体植株，每个处理 3 次重复，并统计加倍植株存活率。加倍植株存活率/%=成活植株数/处理植株数100。1.2.3浸芽法诱导先配制不同质量浓度的秋水仙素（0、200、400、600、800 mgL-1）和不同质量浓度的氟乐灵（0、100、300、500、700 mgL-1），均以 1.5%的 DMSO（二甲基亚砜）作为助溶剂，然后过滤灭菌，再将单倍体植株分别在不同质量浓度的秋水仙素中浸泡 2、4、6 h 和在不同质量浓度的氟乐灵中浸泡 2、3、4 h，以 1.5%的 DMSO 浸芽 6 h 和 4 h 分别作为秋水仙素和氟乐灵浸芽的对照，浸芽结束后，用无菌水冲洗 3 遍，每遍 1 min，最后控干水分，接入基础培养基中（MS+0.15 mgL-1KT+10%椰汁），在上述培养条件中培养 21 d。试验共 30 个处理，每个处理接入 4 株西瓜单倍体植株，每个处理 3 次重复，并统计加倍植株存活率。1.2.4滴生长点法诱导用 1.5%的 DMSO（二甲基亚砜）配制无菌的不同质量浓度的秋水仙素（200、400、600、800 mgL-1）和不同质量浓度的氟乐灵（100、300、500、700 mgL-1），然后分别滴加 2 滴到西瓜单倍体植株的生长点，在 1、3、5 d 各滴加 1次，以滴加 1.5%的 DMSO 作为对照，在上述培养条件中培养 28 d。试验共 9 个处理，每个处理 4 株植株，每个处理 3 次重复，并统计加倍植株的存活率。1.3植株倍性鉴定取待测植株最新长出的嫩叶约 0.2 g，用细胞裂解液与细胞染色液以体积比 1 4 制作细胞悬浮液，用德国 PARTEC 公司的 CyFlowRCube8 流式细胞仪上机检测植株的倍性，以斯维特种子苗为参照。统计植株的加倍率，加倍率/%=加倍植株数/处理存活植株数100。1.4数据处理采用 Excel 2016 进行数据统计分析，采用SPSS 21 进行方差分析，采用 Duncan 检验法进行多重比较，采用 FCS Express V3 对流式细胞仪数据进行作图。26第1期，等：染色体加倍效果的比较研究试验研究李海伦，等：不同诱导剂和诱导方法对西瓜单倍体染色体加倍效果的比较研究2结果与分析2.1植株倍性鉴定西瓜花药离体培养获得的单倍体植株通过秋水仙素和氟乐灵诱导加倍，将获得加倍的存活植株进行流式细胞仪倍性鉴定分析，鉴定结果如图 1 所示，以单倍体植株首个呈正态分布的最高峰的荧光强度 100 为对照，对诱导加倍存活的植株进行鉴定，共得到二倍体和混倍体 2 种倍性植株。单倍体 Haploid二倍体 Diploid混倍体 Mixploid图 1单倍体植株加倍情况Fig.1Doubling of haploid plants250200150100500相对计数Relative count01002004006008001000荧光均值Mean fluorescence intensity2.2培养基添加法对染色体加倍效果的影响将西瓜花药离体培养诱导的单倍体植株进行增殖培养，把获得的单倍体植株接种到含有不同质量浓度的秋水仙素或氟乐灵的培养基中诱导加倍，鉴定的加倍效果如表 1 所示。利用秋水仙素作为诱导剂时，植株的存活率达到 100%，生长良好（图 2-A），随着秋水仙素质量浓度的增加，二倍体的加倍率呈倒“V”形，先增后降，混倍体的加倍率呈线性增加。当秋水仙素质量浓度为 60 mg L-1时，二倍体加倍率达到最大值50.00%；当质量浓度为 100 mgL-1时，混倍体加倍率最高达到 58.33%。利用氟乐灵作为诱导剂时，植株的存活率随着氟乐灵质量浓度的增加而降低，长势较弱（图 2-B），当氟乐灵质量浓度为 100 mgL-1时，植株存活率降至 75.00%，二倍体和混倍体加倍率的变化趋势与秋水仙素加倍效果一致，二倍体和混倍体最高加倍率的质量浓度与秋水仙素一样，其最高加倍率分别为 41.67%和 44.44%。试验结果表明，秋水仙素的加倍效果优于氟乐灵，加倍植株的致死率为 0，而氟乐灵加倍植株的致死率最高达到25.00%，而且二倍体最高加倍率高出氟乐灵 8.33 个百分点，所以质量浓度为 60 mgL-1的秋水仙素作为最佳诱导加倍浓度，同时还发现在不添加诱导剂时，二倍体的加倍率也能达到 8.33%。2.3浸芽法对染色体加倍效果的影响利用不同质量浓度的秋水仙素或氟乐灵对获表 1培养基添加法加倍效果Table 1Doubling effect of medium addition method诱导剂Inducer空白对照Control秋水仙素Colchicine氟乐灵Fluralin/（mgL-1）0406080100406080100存活率Survivalrate/%100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a83.33 b75.00 c加倍率Doubling rate/%单倍体Haploid91.67 a41.67 bc25.00 cd25.00 cd16.67 d50.00 b33.33 bcd30.55 bcd22.22 cd二倍体Diploid8.33 c41.66 ab50.00 a41.67 ab25.00 bc33.33 ab41.67 ab38.89 ab33.34 ab混倍体Mixoploid0.00 d16.67 cd25.00 bc33.33 ab58.33 a16.67 cd25.00 bc30.56 bc44.44 ab注：同列数据后面不同小写字母表示在 0.05 水平差异显著。下同。Note:Different small letters in the same column indicate signifi-cant difference at the 0.05 level.The same below.单倍体 Haploid二倍体 Diploid混倍体 Mixoploid27中国瓜菜第37卷试验研究得的西瓜单倍体芽进行浸芽处理，经流式细胞仪鉴定植株倍性的结果如表 2 和表 3 所示，植株的长势如图 3 所示。秋水仙素诱导二倍体的最高比例（75.00%）高于氟乐灵诱导的最高比例（50.00%）。利用秋水仙素诱导加倍，植株的存活率均达到100.00%，而氟乐灵诱导加倍时植株的致死率最高达 100.00%，表明氟乐灵对植株有一定的毒害作用。由表 2 可知，当秋水仙素浸芽 2 h 时，二倍体的加倍率随着秋水仙素质量浓度的增加呈先降低后升高的变化趋势，最高加倍率为 58.33%，其中400 mgL-1秋水仙素浸芽处理未得到二倍体，其混倍体比例高达 75.00%；浸芽 4 h 时，600 mgL-1秋水仙素浸芽处理二倍体加倍率最高为 75.00%；浸芽6 h 时，二倍体加倍率与秋水仙素质量浓度的增加呈反比，200800 mgL-1秋水仙素浸芽处理使二倍体加倍率由 50.00%降至 33.34%。由表 3 可知，当氟乐灵质量浓度为 100 mgL-1时，二倍体加倍率随着浸芽时间的增加呈现出先升高后降低的变化趋势，浸芽 3 h 时二倍体加倍率达到最大值 50.00%；当质量浓度为 300 mgL-1时，二倍体加倍率与时间的增加呈反比，浸芽 2 h 时二倍体加倍率最高，为 50.00%；当质量浓度为 500 mgL-1时，浸芽 2 h 时没有获得二倍体，只得到 72.22%混倍体；当质量浓度为 700 mgL-1时，只有浸芽 2 h 的处理有存活植株，得到二倍体加倍率为 33.33%。同时发现在 1.5%的 DMSO 溶液中浸芽 6 h 也能得到 16.67%二倍体，植株的加倍率得到提高，表AB注：A.秋水仙素诱导；B.氟乐灵诱导。Note:A.Colchicine induction;B.Fluralin induction.图 2培养基添加法诱导的植株Fig.2Plants induced by medium addition表 2秋水仙素浸芽法加倍效果Table 2Double effect of colchicine soaking bud method/（mgL-1）0200400600800200400600800200400600800处理时间Treatmenttime/h6222244446666存活率Survivalrate/%100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a加倍率Doubling rate/%单倍体Haploid83.33 a58.33 b25.00 c25.00 c16.67 c16.67 c16.66 c8.33 c8.33 c16.67 c16.67 c8.33 c8.33 c二倍体Diploid16.67 e25.00 de0.00 f50.00 bc58.33 b50.00 bc41.67 bcd75.00 a50.00 bc50.00 bc41.67 bcd41.67 bcd33.34 cde混倍体Mixoploid0.00 f16.67 ef75.00 a25.00 de25.00 de33.33 cde41.67 bcd16.67 ef41.67 bcd33.33 cde41.67 bcd50.00 bc58.33 ab28第1期，等：染色体加倍效果的比较研究试验研究明 DMSO 辅助剂对植株加倍具有一定的促进作用。综合植株存活率和加倍率分析可知，秋水仙素诱导加倍效果好于氟乐灵，最佳诱导方法为600 mgL-1的秋水仙素浸芽 4 h。2.4滴生长点法对染色体加倍效果的影响利用不同质量浓度的秋水仙素和氟乐灵对西瓜单倍体植株的生长点滴加诱导剂进行加倍，通过流式细胞仪鉴定的结果如表 4 所示，加倍植株的生长情况如图 4 所示。二倍体的最高加倍率只有50.00%，由 600 mgL-1的秋水仙素处理所得。利用秋水仙素诱导液加倍时，植株的存活率都达到了表 4滴生长点法加倍效果Table 4Doubling effect of drop growth point method诱导剂Inducer空白对照Control秋水仙素Colchicine氟乐灵Fluralin/（mgL-1）0200400600800100300500700存活率Survivalrate/%100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a58.33 b0.00 c加倍率Doubling rate/%单倍体Haploid91.67 a33.33 b16.67 bc8.33 bc8.33 bc33.33 b16.67 bc11.11 bc0.00 c二倍体Diploid8.33 cd33.34 ab41.67 ab50.00 a33.34 ab25.00 bc25.00 bc27.78 bc0.00 d混倍体Mixoploid0.00 b33.33 a41.67 a41.67 a58.33 a41.67 a58.33 a61.11 a0.00 b注：A.秋水仙素诱导；B.氟乐灵诱导。Note:A.Colchicine induction;B.Fluralin induction.图 3浸芽法诱导的植株Fig.3Plants induced by soaking budsAB/（mgL-1）0100100100300300300500500500700700700处理时间Treatmenttime/h4234234234234存活率Survivalrate/%100.00 a100.00 a100.00 a100.00 a83.33 a58.33 b41.67 bc58.33 b33.33 c0.00 d41.67 bc0.00 d0.00 d加倍率Doubling rate/%单倍体Haploid91.67 a33.33 b8.33 b25.00 b30.56 b27.78 b33.33 b27.78 b16.67 b0.00 b16.67 b0.00 b0.00 b二倍体Diploid8.33 b33.33 ab50.00 a33.33 ab50.00 a27.78 ab16.67 ab0.00 b16.67 ab0.00 b33.33 ab0.00 b0.00 b混倍体Mixoploid0.00 b33.34 ab41.67 ab41.67 ab19.44 ab44.44 ab50.00 ab72.22 a66.67 a0.00 b50.00 ab0.00 b0.00 b表 3氟乐灵浸芽法加倍效果Table 3Double effect of fluralin soaking bud method李海伦，等：不同诱导剂和诱导方法对西瓜单倍体染色体加倍效果的比较研究29中国瓜菜第37卷试验研究注：A.秋水仙素诱导；B.氟乐灵诱导。Note:A.Colchicine induction;B.Fluralin induction.图 4滴生长点法诱导的植株Fig.4Plants induced by drop growth point methodAB100.00%，而 500 mgL-1的氟乐灵处理时植株的存活率只有 58.33%，700 mgL-1的氟乐灵处理时植株的存活率为 0，说明氟乐灵对植株的毒害作用较大。随着秋水仙素质量浓度的增加，二倍体加倍率呈先升高后降低的变化趋势，600 mgL-1时达到最大值，为 50.00%；混倍体一直保持递增的变化趋势，800 mgL-1时达到最大值，为 58.33%。随着氟乐灵质量浓度的增加，二倍体和混倍体加倍率均呈先升高后降低的变化趋势，但二倍体的加倍率低于秋水仙素处理，最高加倍率只有 27.78%，500 mgL-1时混倍体的加倍率最高，达到 61.11%。试验结果表明，滴生长点加倍的最佳方案为600mgL-1秋水仙素。3讨论与结论多倍体诱导时常用的诱导剂主要有秋水仙素、除草剂类物质（氟乐灵）、植物激素（激动素）等化学诱变剂，这些诱导剂对处在分裂旺盛期的细胞都具有一定的影响，能抑制细胞有丝分裂，从而使染色体加倍，同时添加 DMSO 等辅助剂，将会有效地提高植株加倍率。其中秋水仙素是典型的诱导剂，在苹果23、黄瓜20、非洲菊24等很多种作物上都取得了一定成果，而氟乐灵作为诱导剂的使用范围相对狭隘。笔者利用秋水仙素和氟乐灵 2 种化学诱变剂对单倍体西瓜进行诱导加倍，结果表明，秋水仙素诱导加倍的植株存活率均达到 100.00%，且长势良好；氟乐灵诱导的加倍植株致死率最高达到100.00%，且呈现出一种病态的长势。秋水仙素诱导二倍体的最高加倍率为 75.00%，高于氟乐灵诱导二倍体的最高加倍率 50.00%。李丽25在诱导萱草多倍体的研究中，发现秋水仙素和氟乐灵的诱导率没有明显区别，而褚丽红等26对安祖花的研究结果表明，氟乐灵的诱导效果好于秋水仙素，可能与不同的植物对不同诱导剂的敏感程度存在差异有关，但具体原因还有待进一步研究。笔者还发现在不添加任何诱导加倍剂的条件下，在含有激素 KT、椰汁等基础培养基中诱导也能得到 8.33%的二倍体，在通过 1.5%DMSO 处理后再接入基础培养基诱导，二倍体的诱导率能达到 16.67%，说明 KT 具有一定的加倍功效，DMSO 具有辅助提高植株加倍率的功能，朱惠琴27在烟草上的研究也表明 DMSO 对加倍具有促进作用。多倍体诱导的效果与诱导方法有着直接的关30第1期，等：染色体加倍效果的比较研究试验研究系。常用的有浸芽、浸种、浸根、浸苗、滴生长点和组培法等多种诱导方法。笔者利用不同质量浓度的秋水仙素和氟乐灵 2 种诱导剂通过不同的诱导方法，诱导的二倍体加倍率在 075.00%。在培养基添加法诱导加倍过程中，二倍体的加倍率随着 2 种诱变剂质量浓度的增加均表现先升高后降低的变化趋势，均在60 mgL-1时达到最大值，分别为 50.00%、41.67%，均高于高宁宁等14的培养基添加法（37%）。浸芽法诱导加倍时，600 mgL-1秋水仙素浸芽 4 h 时达到二倍体最高加倍率 75.00%，300 mgL-1氟乐灵浸芽 2 h 得到最高二倍体加倍率 50.00%。从最佳诱导效果上来看，秋水仙素在质量浓度和浸芽时长上都要高于氟乐灵，而氟乐灵在植株长势和诱变率上都低于秋水仙素，在李丽25的研究中秋水仙素处理时长同样高于氟乐灵处理，但诱导率却没有明显的差异，可能是不同作物的倍性与诱变剂的剂量和处理时间有关。滴生长点诱导加倍法的研究比较少，在李勤菲等17对芸薹属 3 种单倍体染色体加倍中有研究报道，在笔者的研究中不同质量浓度的秋水仙素滴生长点诱导二倍体加倍率均高于氟乐灵，诱导率最高为 50.00%，但 2 种诱变剂的诱导率均高于李勤菲等17的 17.54%的加倍率，可能是不同的作物对不同质量浓度的诱变剂的敏感程度不同。植物染色体倍性的改变是一个复杂的生理生化变化过程，受植物基因型、诱变剂类型和外界环境条件等多种因素的影响。因此，还需要进一步利用基因工程技术探讨染色体加倍的分子机制，以提高西瓜单倍体的加倍率，加快双单倍体育种的进程。笔者通过利用培养基添加法、浸芽法和滴生长点法 3种不同的加倍技术对西瓜单倍体加倍的效果进行研究，结果表明，浸芽法加倍效果最佳，秋水仙素诱导剂效果好于氟乐灵诱导剂，其二倍体诱导率和植株长势均优于其他。600 mgL-1秋水仙素浸芽 4 h，二倍体加倍率达到最高，为 75.00%。研究结果为西瓜单倍体快速获得纯合的双单倍体提供了技术参考，同时获得的西瓜多倍体种质丰富了育种材料，对加快育种进程、提高育种效率具有重要意义。参考文献1马超，曾剑波，朱莉，等 北京西瓜产业发展 40 年来回顾及展望J 中国瓜菜，2022，35（2）：112-1172杨红，顾妍，张朝阳，等 辐射花粉授粉诱导西瓜单倍体J 江苏农业科学，2017，45（22）：159-1613李慧，赵林姝，古佳玉，等 小麦花药培养体系优化及高再生力基因型的筛选J 植物遗传资源学报，2022，23（3）：738-7454ALI J，NICOLAS K L C，AKTHER S，et al Improved antherculture media for enhanced callus formation and plant 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