动物细胞培养及应用发展史.doc

细胞培养技术细胞培养发展史及其应用（一）前言20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。（二）细胞培养技术及其历史细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载Wilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。 1903年，Jolly将蝾螈的白细胞保存在悬滴并维持了十个月。 1906年，Beebe和Ewing在动物的血液中尝试培养了传染性巴肉瘤的细胞。可是，由于当时的培养基并不理想，因此实验难以重复，并且也难以证明这些先躯者所培养的是否是真正存活的健康的组织和细胞。结果都和Welhelm ，一样只能维持离体细胞的短期存活,而没有细胞的生长和增殖。直到1907年，美国胚胎学家Ross Harrison的实验才被公认为组织培养真正开始的标志，因为该实验但提供了可重复的技术，而且证明了生物组织的功能可以在体外十分明确地延续下去。Ross Harrison将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且居然还从细胞中长出了轴突(神经纤维)， 解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。他所采用的把培养物放在盖玻分上并倒置于凹玻片腔中的方法还一直沿用至今，称为盖片复盖凹窝玻璃悬滴培养法 。在此基础上，1912年Carrel 则更加丰富和完善了此项技术，他将无菌操作技术引入动物细胞培养，在没有使用抗菌素的条件下使鸡胚心脏细胞在人工培养条件下生存了34年，并且先后传代3400次。并发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈促进作用的生长因子。这一结论早已被现在的研究所证实，并成为无血清培养基研究的基础。由于这两个人的卓越成就，细胞培养从此开始了迅猛的发展，并成为生物工程特别是细胞工程中一项重要的基础技术.1912年，当时的Carrel是外科医生，在实验中特别注意无菌操作。他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，并采用了更新培养基和分离组织的传代措施，从而完善了经典的悬滴培养法（Suspension Culture）。Carrel用这种方法，曾培养一鸡胚心肌组织长达数年之久。这些创造性的工作充分揭示：离体的动物组织在培养条件下，具有近于无限的生长和繁殖能力；并充分证明组织培养的确是研究活组织和细胞的极好方法。1924年Maximow又把Carrel的悬滴培养法改良为双盖片培养，使之更易于传代和减少污染。Carrel又设计了用卡氏瓶培养法，扩大了组织的生存空间。自悬滴培养问世后的30年中，以Harrlson和Carrel为首的科学家们，用这些方法对各种组织在体外生长的规律和细胞形态进行了深入的研究，发表了大量论文，为组织培养的进一步发展奠定了巩固的基础。（三）动物细胞的培养方法（1）贴壁培养法大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法) 或化学(酶消化法) 的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板) 中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层,生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。（2）悬浮培养少数动物细胞属于悬浮生长型，这些细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长，如淋巴细胞和肿瘤细胞。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物组织经分散、过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好生长。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快、产量高、培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数种类的细胞适于悬浮培养。 大规模培养法动物细胞大规模培养技术是在贴壁培养和悬浮培养的基础上融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应罐技术以及人工灌流和温和搅拌系统等技术后发展起来的。始于20 世纪60 年代初Capstick 及其同事为生产FMD 疫苗而对BHK 细胞的研究。其后，随着生物技术产品倍受世人亲睐，动物细胞大规模培养技术也随之得到了迅猛发展，并形成了几种比较成熟且有应用价值的大规模培养方法。 空心纤维法：空心纤维培养法是Richard kncazek 等在1972 年创建的。最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜，外径约为1/33/4mm ，表面具有海绵状多孔结构，既能使水分子、营养物质和气体透过，也能使细胞在上面贴附生长。这种培养系统的核心部分是由36层这样的空心纤维组成的，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔，培养一段时间后，当细胞密度达到107-107个/ml时逐渐用无血清培养液代替含血清培养液。此时细胞虽不再增殖，但能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。由于这种培养方法在分离和纯化分泌物时很方便，因而在生产激素和单抗时被广泛应用。并相继开发出了由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的新的空心纤维培养系统。 微载体法：微栽体法是Wezel 在1967 年首先创建的。所采用的微栽体是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固体小珠，其直径约在50 微米到数百微米之间。培养动物细胞时先将微载体在血清中浸泡一下(可加快细胞与微载体的贴附速度) ，然后将制备好的细胞悬液和微载体混合孵育一段时间，待细胞贴附于微载体上后再转移至培养液中培养，并借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。这样细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖，细胞浓度可高达107个/ml 。微载体法是一种完全将贴壁培养和悬浮培养融为一体的培养方法。因而不但能使细胞均匀分布，提高了对培养液和培养空间的利用，而且适于各种细胞的大规模培养，收获过程简单，放大生产也很容易。因而是一种比较理想的大规模培养方法。只是此法对微载体的要求较高。 微囊法: 微囊法是美国Damon Biotech 公司创建的一种比较理想的大规模动物细胞培养法。其基本技术是：先将欲培养的动物细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，之后使其通过一种成滴装置(微囊发生器) 而逐滴滴入CaCl2 溶液中，海藻酸钠一旦进入CaCl2 溶液后即形成半透膜微囊，从而将细胞封闭在其内。然后再将这种包含有细胞的微囊悬浮于培养液中培养。这样培养液中的水和营养物质可透过半透膜进入微囊供应给细胞,细胞的代谢物也可透过半透膜被排出,而细胞分泌的大分子物质则被阻留而积累与囊内。当培养一段时间后，在细胞密度达到107/ml时即可分离收集微囊，最后破开微囊就能获得高度纯化的大分子产物。细胞培养工作中，以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。（四）应 用（1）在生物学基础研究中的应用离体培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测的特点，因而可广泛应用于生物学领域的基础研究中。在细胞生物学上，动物细胞培养可用于研究动物的正常或病理细胞的形态、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。如神经细胞的增殖、突起生长、相互识别、刺激传递等机理就是通过进行各种神经细胞的培养才弄清楚的。在遗传学研究中，除可用培养的动物细胞进行染色体分析外，还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学进行遗传分析和杂交育种；在胚胎工程中通过体外培养卵母细胞并进行体外受精、胚胎分割和移植已发展成了一种较成熟的技术而应用于家畜的繁殖生产中。另外，分离和培养具有多潜能性的胚胎干细胞，还可用于动物克隆、细胞诱导分化、动物育种的研究，并可作为基因转移的高效表达载体；在病毒学研究中用培养的动物细胞代替试验动物做斑点分析，不仅方法简便、准确、而且重复性好。（2）在临床医学上的应用首先，动物细胞培养技术可用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断。目前，人们已经能够用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水中的胎儿细胞经培养后进行染色体分析或甲胎蛋白检测即可诊断出胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型，以此可避免先天残疾儿的诞生。现在用这种方法已能检测出几十种代谢性遗传缺陷疾病和先天畸型疾病。其次，现在的一些科学研究已能通过染色体对比分析检测出易患癌症的病人，以便进行及早的预防和治疗。在这方面我国的科学工作者有较突出的研究成果：他们改进了淋巴细胞的培养方法，从而使带有癌基因的人的染色体表现出明显高于常人的畸变率，这就从细胞分子水平揭示了癌症的病理、病因，并为癌症的早期诊断和预防提供了科学依据。再次，细胞培养还可用于临床治疗。目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。另外，动物细胞培养生产的生物大分子制品也可用于治疗某些代谢缺陷疾病。（3）在动物育种上的应用目前，由于细胞培养技术、细胞融合技术、细胞杂交技术以及转基因技术的创建与相互结合，使得人们能够在细胞水平操作并改变动物的基因进行遗传物质的重组。这样就可以按照人类的需要大幅度地改变生物的遗传组成，从而使新品种的培育在实验室中即可完成，可大大缩短育种进程，且使育种工作更加经济有效。胚胎干细胞的研究成果和克隆羊多莉的问世可以说已为动物遗传育种开辟了一条新途径。（4）可用于生产大分子生物制品利用动物细胞大规模培养技术生产大分子生物制品始于上世纪60 年代,当时是为了满足生产FMD 疫苗的需要。后来随着大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用,人们发现利用动物细胞大规模培养技术来生产大分子药用蛋白比原核细胞表达系统更有优越性。随着大量永久性细胞株的创建,在商业利益的刺激下,动物细胞大规模培养技术也迅速发展起来,并被付之于应用。目前，用动物细胞可生产的生物制品有各类疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、病毒杀虫剂、单克隆抗体等，其销售收入已占到世界生物技术产品的一半以上。我们相信，随着动物细胞培养技术的发展，以后还会有更多的生物制品被开发并用于造福人类。动物细胞培养基的发展及应用（一） 引言近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生物学研究和商业利用的许多方面，成为广泛采用的技术手段。许多生物技术科学研究和产品的生产都离不开细胞培养。在细胞培养发展史中，细胞培养基的发展占有很重要的位置。动物细胞培养基是体外细胞培养的重要因素。根据培养基的来源及成分的明确程度，动物细胞培养基的发展大致可分为3个阶段：天然培养基阶段、合成培养基阶段、无血清培养基阶段。（二）动物细胞培养基发展及其应用（1） 天然培养基阶段 这一阶段是动物细胞培养基的最初及摸索阶段。此阶段早期机械模拟细胞的体内生存环境，直接采用某些组织凝块，生物性液体和组织提取液等作为组织细胞的培养基为特征。如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液等。据记载，最早进行组织培养的是Roux采用温生理盐水培育鸡胚组织，使之存活了数月之久。随之，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功的在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立体外培养方法。后期便开始了对维持细胞生长的营养成分的研究，并为合成培养基阶段的到来打下了基础。但当时由于条件所限始终没有稳定的发展起来。（2） 合成培养基阶段合成培养基是根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。研究表明合成培养基由于成分清楚，故可通过改变或调节各种成分的种类、数量和比例，观察细胞生物特有的反应性变化，测知细胞与外界环境的关系，了解细胞生存条件并可诱导细胞定向分化等。自从发现鸡胚组织能在辅加各种氨基酸和多肽Locke溶液中存活一段时间，在含有葡萄糖和麦芽糖的培养液中能存活持久些以来，在随后时间里人们设计了许多添加各种辅助成分的培养基。常用合成培养基的种类和特点一般是依据条件、经验和培养基的特点选用。目前常用的是MEMEagle、RPMI1640培养液等。绝大多数细胞的体外培养需要在合成培养基中补充一定量的成分不明确的生物性液体或组织提取液才能支持细胞的生长增殖，其中血清因来源丰富且易于保存而成为被最广泛采用的培养基添加物，最常用的为小牛血清。小牛血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，对促进细胞生长与抑制生长活性是生理平衡的，它不是一种简单的液体，它含有各种血浆蛋白质、脂肪、碳水化合物、无机物质等。血清的营养作用是极大的补充营养液配方的成分，但是血清中所含的成分复杂。就蛋白质而言，血清中所含的蛋白成分不少于150种。这就给动物细胞培养造成了诸多不利的因素：血清非常昂贵，血清的费用占到培养基费用的50，致使生产成本大幅度提高。 血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等下游培养产物的分离纯化带来很大的困难。 批次与批次之间血清质量的差异会影响细胞生长，最终影响产品质量。血清易被支原体和杂质污染。也正是由于血清的应用存在上述问题才促使人们对无血清培养基的研究和应用日益重视。为了多种理由除去血清中的不确定成分，创造一种完全化学成分明确的培养液将是一个具有巨大进展意义的工作。（3） 无血清培养基阶段 无血清培养基就是在合成培养基的基础上，引入成分完全明确的或部分明确的血清替代成分，使培养基能满足动物细胞培养的要求，又可有效的克服因使用血清所引发的问题。由于无血清培养基可以是完全采用已知分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培养基，因而它不仅为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了有力的工具，而且为现代生物技术尤其是细胞工程的应用准备了更好的条件。1975年，Hayashi等在培养基中用激素代替血清使垂体细胞株Gh3在无血清介质中生长获得成功，预示着无血清培养基的诱人前景。进入2O世纪80年代后，新的无血清培养基不断问世，人们经过研究发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等 砌，不少细胞即能在无血清供应的情况下生长口”。尤其是CHO、杂交瘤、骨髓瘤细胞以及BHK细胞等f 51。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。另外，动物细胞培养应用无血清培养基的成功，还将为某些疫苗的生产降低成本。这些都足以说明动物细胞无血清培养基的研究和应用进入了新的时期。无血清培养基的优势：采用无血清培养基培养动物细胞大致有如下好处：可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和试验结果的重复性；避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；避免血清组分对试验研究的影响；有利于体外培养细胞的分化； 可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。虽然有上述这些好处存在，但无血清培养基也并非完美无缺。其不足之处主要表现为细胞的适用谱极窄，细胞在无血清培养基中更易受某些机械因素和化学因素的影响以及培养基难以保存等，皆不如传统的添加小牛血清。无血清培养基的分代：目前，无血清培养基已进入第3代，第l代无血清培养基虽然不合血清，但含有大量的动物和植物蛋白如牛血清白蛋白BSA和动物的刺激激素等，虽然其总蛋白量明显低于有血清培养基，但蛋白含量依然很高。因此厂商致力于发展第2代无血清培养基，其主要特点是完全不用动物来源蛋白，称之为无血清，无动物衍生蛋白。它的优点是既可降低生产成本，又能加快报批的速度， 因为政府药品监管部门对产品是否用含无血清培养基生产相当关注。由于生物工程的要求，第3代无血清培养基近年已出现，即完全没有蛋白或含量极低，称之为双无培养基，即Serumfree，Proteinfree培养基。这带来下述几个方面的好处：首先是因为培养基全为化学已知物，因此细胞培养与生产很容易做到恒定；其次是细胞分泌的目标蛋白的分离纯化更为容易；最后是细胞培养基的成本(指原材料成本，不包括研究开发费用)大为下降，生产中品质管理更加容易。早期的无血清培养基其两个主要指标即细胞生长速率和细胞密度都低于有血清培养基，现在的无血清培养基在上述两个指标包括蛋白分泌量都不亚于血清培养基，甚至更好。目前预测第4代无血清培养基将会进入研究与开发，这将是一种无血清、无蛋白、又可以高温消毒的适合于许多种不同细胞生长的全能型培养基。无血清培养基的应用:近年的实践证明，使用无血清培养基在细胞的生长速率和细胞密度及蛋白的表达水平都不亚于血清培养，甚至在某些方面超过血清培养，而这正是评价细胞培养基的几个重要指标。无血清培养基尚存在不足的方面，但其显著的优势将使无血清培养技术逐步取代含血清细胞培养。无血清培养基已广泛的应用于细胞生物学、药理学、肿瘤学和细胞工程领域。无血清培养基的应用主要表现在以下几个方面：研究细胞的分化条件：目前已有许多在含血清的培养基中不能保持原代细胞分化现象的细胞系，在无血清培养基中成功地保留着分化能力和分化现象。如人结肠癌细胞LIMI1863在无血清培养基的培养下保持着肾脏的转运功能；用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究；用于从多种细胞混杂的培养中选择目的细胞，通过对无血清培养基中的某些成分的取舍，可抑制原代组织培养物中非目的细胞的过度生长，达到选择目的细胞的目的； 肿瘤病理学和病因学的研究：如用于研究致癌因子对细胞的影响，研究肿瘤细胞对可能触发正常细胞终末分化的外周信号的反应能力，或用于研究正常细胞与肿瘤细胞的生长和移行与基底膜信号的关系等；用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品。这可以说是无血清培养基最重要的同时也是最有发展前景的应用领域。一方面是由于无血清培养基的成分明确、质量一致、蛋白含量低，因而有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化；另一方面是可通过对培养基成分的优化，使不同的细胞能各自在最有利其生长或最有利于表达目的产物的环境中持续高密度培养。(三)展望经过几十年来的研究与实践应用，大规模动物细胞培养技术已日趋完善。随着这一技术的进一步发展，人们还将不断努力设计理想的生物反应器以获得高密度、高活力的细胞开发新的无血清培养基，使生物制品更安全，建立细胞培养与产物分离的耦合系统，充分利用培养液以降低生产成本等，动物细胞培养技术将在生物制备和基因工程等领域得到更广泛的应用圈。尤其是无血清培养基的发展更为迅速。无血清培养基具有许多传统的含血清培养基无法比拟的优势，但还有许多不足之处有待改善。首先，无血清培养基只能用于一种或少数几种细胞高密度生长或高水平表达目的产物，缺少通用性，有待于研究具有广泛适应性的无血清培养基。其次，将无血清培养基与发酵罐培养技术相结合成为一个新的研究热点，如何将其应用于发酵工程进行大规模生产目的产物将有待于继续研究与关注。另外，无血清培养基目前还存在成本高的问题，因而降低其成本的方法值得探索。