H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45,No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202302015H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建杨佳欣,刘文宇,李炯颉,陈普成,柳金雄,陈化兰,姜永萍*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室/国家禽流感参考实验室,黑龙江 哈尔滨 150069)摘要:H7N9亚型禽流感病毒(AIV)持续给家禽及人类健康造成威胁。为构建H7N9亚型AIV(简称H7N9AIV)
2、mRNA疫苗,本研究以AIV分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)的HA基因为目的基因、选择来自人茁-球蛋白和非洲爪蟾茁-球蛋白的不同编码基因序列作为HA基因的非翻译区(UTR),构建了中间转录质粒pGEM-YN和pXT7-YN,以2个质粒为模板通过体外转录制备了mRNA mH7-YN-pGEM和mH7-YN-pXT7;将2种mRNA转染HEK293T细胞,western blot鉴定结果显示2种mRNA转染的细胞均可检测到约为70 ku的HA蛋白条带和50 ku的HA1蛋白条带;通过间接免疫荧光试验(IFA)确定最适转
3、染剂量和HEK293T细胞中HA蛋白的动态表达,结果显示,3 滋g mRNA转染106个细胞并于转染24 h后荧光信号强度均最强;将2种mRNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF),均可通过IFA检测到HA蛋白的表达。以上结果表明,本研究正确构建了2种含H7N9 AIV HA基因的mRNA,且其均能够在HEK293T细胞和CEF中正确表达HA蛋白,3 滋g mRNA转染HEK293T细胞可获得最佳的蛋白表达水平,转染24 h后HA蛋白的表达水平达到最高。本研究基于UTR序列的差异首次正确构建了两种能在哺乳动物细胞和禽类细胞中高效表达H7N9 AIV HA蛋白的mRNA,为禽流感mRNA疫苗的研发和免疫
4、效力评估奠定了良好的物质和技术基础。关键词:H7N9;禽流感病毒;mRNA;UTR;HA基因中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)08-0771-08Construction of mRNA containing HA gene ofH7N9 avian influenza virusYANG Jia-xin,LIU Wen-yu,LI Jiong-jie,CHEN Pu-cheng,LIU Jin-xiong,CHEN Hua-lan,JIANG Yong-ping*(National Avian Influenza Reference Labora
5、tory,State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention,Harbin Veterinary ResearchInstitute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract:H7N9 avian influenza virus(AIV)poses an insistent threat to poultry production and public health.In order todevelop mRNA vacci
6、ne against H7N9 AIV,the intermediate transcription plasmids pGEM-YN and pXT7-YN were constructed byusing the gene sequences of human 茁-globin and Xenopus laevis 茁-globin as UTRs and the HA gene of AIV strainA/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)(CK/YN/SD024/2021)as target gene.The mRNA mH7-YN-pGEM and mH
7、7-YN-pXT7were prepared bytranscription with above two plasmids as template.The two mRNA were transfected into HEK293T cellsrespectively,about 70ku HA protein and 50ku HA1 protein of CK/YN/SD024/2021 strain could all be detected by the western blotanalysis.Thentheoptimaltransfectiondoseandthedynamice
8、xpressionofHAproteinwasdetectedbyindirect收稿日期:2023-02-19基金项目:国家重点研发计划课题(2022YFD1800603)作者简介:杨佳欣(1997-),女,山东济宁人,硕士研究生,主要从事动物疫苗及分子免疫学研究.*通信作者:E-mail:*Corresponding authorimmunofluorescence assay(IFA).The results showed that the strongest fluorescence signal intensity was detected when 106cellswere tra
9、nsfected with 3滋g mRNA at 24 hours after mRNA transfection.The two mRNA were transfected into chicken embryofibroblast(CEF)cells respectively,and the HA protein could be detected by IFA in CEF cells after mRNA transfection.Based onabove results,mRNA mH7-YN-pGEM and mH7-YN-pXT7 were constructed corre
10、ctly and the HA protein of H7N9 AIVCK/YN/SD024/2021 strain was successfully expressed in HEK293T cells and CEF cells.The optimal transfection dose was 3滋g,and the expression of HA protein reached its peak at 24 hours in HEK293T cells after transfection.In this study,two mRNA wereconstructed for the
11、first time based on the different UTR sequences and could express HA protein of H7 subtype AIV effectively inboth mammalian cells and avian cells.The work laid a good material and technique foundation for the subsequent development andefficacy evaluation of avian influenza mRNA vaccine.Key words:H7N
12、9;avian influenza virus;mRNA;UTR;HA geneH7N9 亚 型 禽 流 感 病 毒(Avian influenza virus,AIV)感染人可以引起严重的呼吸系统疾病,并可导致人的死亡1。给家禽接种疫苗是防治高致病性禽流感的主要措施,目前以接种灭活疫苗为主,另外对重组病毒活载体疫苗和DNA疫苗等也陆续进行了免疫效力评估2-6。我国于2017年9月在鸡群中推广免疫H5/H7二价灭活疫苗后,有效阻断了H7N9亚型AIV(简称H7N9 AIV)在家禽中的流行,并阻断了病毒由禽向人的传播7。然而,由于AIV基因变异频繁,H7N9 AIV仍偶尔在少数家禽群中低水平流行
13、,该病毒对家禽及人健康的威胁依然存在,因此需要进一步研发能够快速应对变异以及具有良好应用前景的新型疫苗。从1960年发现mRNA,到1990年体外合成的mR-NA第一次在细胞内表达,再到2020年mRNA疫苗作为抗击新冠疫情的主要疫苗类型之一,mRNA疫苗进入了快速发展的时期8-10。目前有多项关于新冠mRNA疫苗临床实验的报道,显示mRNA疫苗可以诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答,从而对机体提供完全的免疫保护10-11。针对其他传染病病原如流感病毒、狂犬病病毒等的mRNA疫苗研究也取得了进展,部分疫苗已经进行了临床试验12-13。mRNA疫苗具有翻译效率及安全性高、体外转录技术成熟、研发周期
14、短、生产工艺简单等优点,具有良好的发展前景。mRNA自身的结构对其表达效果有很大影响,包括5端Cap结构、3端Poly(A)尾的长度、是否引入修饰核苷酸、5和3端非翻译区(Untranslated region,UTR)的设计等14。其中,5和3端UTR基因序列的选择对于mRNA的翻译能力和稳定性有很大的影响。将茁-球蛋白编码基因作为UTR序列已被证明对于增强mRNA稳定性有明显作用15。为探究和构建有效的禽流感mRNA疫苗,本研究分别选择来自人茁-球蛋白和来自非洲爪蟾茁-球蛋白的部分编码基因序列作为HA基因mRNA的UTR序列,以pGEM 和pXT7两种不同载体的HA基因mRNA的构建策略,
15、分别构建含H7N9 AIV 分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)HA基因的mRNA,通过间接免疫荧光试验(Indirectimmunofluorescence,IFA)和western blot试验鉴定构建的mRNA能够在哺乳动物细胞和禽类细胞中表达HA蛋白,并确定了mRNA转染HEK293T细胞的体外最适转染剂量,探究了mRNA转染HEK293T细胞后HA蛋白表达水平的动态变化,为禽流感mRNA疫苗的研发以及后续H7N9 AIV mRNA疫苗效力评估试验奠定了必要的技术基础。1材料与方法1.1主要实验材料含H7N9
16、AIV分离株CK/YN/SD024/2021 HA基因的质粒pCA-YN由本实验室构建和保存;含T7启动子和非洲爪蟾源茁-球蛋白部分编码基因的质粒pXT7购自Addgene公司;含T7启动子的载体质粒pGEM-3Zf(+)购自Promega公司;人源茁-球蛋白编码基因片段由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成;HEK293T细胞由本实验室保存。1.2主要试剂HiScribeTMT7 ARCA mRNA Kit(withtailing)、Monarch RNA Cleanup Kit(50 滋g)、Q5RHigh-Fidelity DNA Polymerase和限制性内切酶购自NEB 公司;Pse
17、udo-UTP、5-Methyl-CTP购自Apexbio中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年772公司;兔源GAPDH多克隆抗体(pAb)购自Proteintech公司;LipofectamineTM3000、FITC标记的羊抗鸡IgY、Alexa Fluor 488 dye标记的羊抗兔IgG购自Invitrogen公司;IRDye 800CW标记的驴抗鸡IgG购自LI-COR公司;鸡源H7N9(CK/YN/SD024/2021)HA单因子血清由本实验室制备并保存。1.3引物的设计与合成利用Primer Premier5.0 软件,根据CK/YN/SD024/2021株的HA基因序列设
18、计构建含骨架质粒pGEM的引物,以及通过同源重组构建含另一骨架质粒pXT7的引物(表1),引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成。1.4H7N9 AIV HA基因重组质粒pGEM-YN的构建与鉴定将合成的人源茁-球蛋白编码基因片段经d 和I酶切后与经同样酶切的pGEM-3Zf(+)载体连接,构建重组质粒pGEM-茁-globin;以质粒pCA-YN为模板,利用引物SD024-pGEM-F/R经PCR扩增HA基因,扩增产物经I和I酶切后与经同样酶切的pGEM-茁-globin质粒连接(图1),构建重组质粒pGEM-YN并进行琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定。1.5H7N9 AIV HA基因重组质粒p
19、XT7-YN的构建与鉴定以质粒pCA-YN为模板,利用引物SD024-pXT7-F/R经PCR扩增带有pXT7同源臂的HA基因,以载体质粒pXT7为模板,利用引物pXT7-F/R通过PCR方式线性化pXT7,通过同源重组酶ClonExpressRII One Step Cloning Kit将HA基因和线性化pXT7连接(图1),构建重组质粒pXT7-YN,并进行琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定。1.6H7N9 AIV HA基因mRNA的体外转录质粒pGEM-YN经d 酶切后线性化,质粒pXT7-YN经I 酶切后线性化。以线性化质粒为模板,按照HiScribeTMT7 ARCA mRNA Kit(
20、with tailing)方法配置体系并设置反应程序,分别将1.4和1.5中构建的质粒体外转录为mRNA(mH7-YN-pGEM和mH7-YN-pXT7),在体系配制过程中,加入修饰核苷酸Pseudo-UTP 和 5-Methyl-CTP。体 外 转 录 产 物 利 用Monarch RNA Cleanup Kit(50 滋g)纯化,纯化后的mRNA于-80 保存。1.7H7N9 AIV HA基因mRNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测将0.36 g琼脂糖加至21.6 mL DEPC处理水中微波加热溶解,随后加入3 mL 10伊MOPS RNA电泳缓冲液以及5.4 mL 37%甲醛,制成1.2%的甲
21、醛变 性 琼 脂 糖 凝 胶。将 mRNA 样 品、RL6000 RNAMarker分别与RNA Loading Buffer(+EB)等体积混合,65 加热10 min后点样,在1伊甲醛变性琼脂糖凝胶电泳缓冲液中150V电压条件下电泳20 min。电泳结束后,将凝胶在DEPC处理水中浸泡15 min,除去凝胶中的甲醛,扫描成像。1.8H7N9 AIV HA基因mRNA转染细胞后HA蛋白表达的western blot鉴定细胞计数后,将HEK293T细胞以1伊106个/孔铺于6孔细胞培养板,待细胞融合度为80%时,利用转染试剂LipofectamineTM3000将mH7-YN-pGEM和mH7
22、-YN-pXT7分别以4 滋g/孔转染HEK293T细胞。同时以相同剂量转染pCA-YN作为阳性对照,正常HEK293T细胞作为阴性对照。转染细胞24 h后采用5伊SDS上样缓冲液裂解细胞收取蛋白,经SDS-PAGE电泳后,利用eBlotTML1快速湿转仪将蛋白从凝胶中转移至硝酸纤维素膜(NC)上,以5%脱脂 乳作为 封闭液。以 鸡源 H7亚 型(CK/YN/SD024/2021)HA单因子血清(1颐200)作为一抗;IRDye800CW 标记的驴抗鸡IgG(1颐5 000)作为二抗。兔源GAPDH pAb(1颐5 000)作为一抗;Alexa Fluor 488 dye标记的羊抗兔IgG(1
23、颐5 000)作为二抗。采用westernblot鉴定H7N9亚型AIV HA蛋白的表达。1.9H7N9 AIV HA基因mRNA最适转染剂量的IFA表 1引物序列引物PrimersSD024-pGEM-FSD024-pGEM-RpXT7-FpXT7-RSD024-pXT7-FSD024-pXT7-R引物序列(5-3)Primer sequences(5-3)ATCGATACGAATTCGCCGCCACCATTAATTAAAACTCGAGTTAGATGCAGATGTAATCTAGTGACTGACTAGGATCTGGTTACGGTACCGATCTGCCAAAGTTGAACTTTGGCAGATCG
24、GTACCACGAATTCGCCGCCACCATGCAGATCCTAGTCAGTCACTAGATTAAACTCGAGTTAGATGCAGATGGTGC图1两种构建策略示意图杨佳欣,等.H7N9 亚型禽流感病毒 HA 基因 mRNA 的构建第 8 期773In vitrotranscriptionIn vitrotranscriptionAAAAAAA3 poly(A)tail3 UTR5 UTRHA gene3 UTR5 UTRHA geneAAAAAAA3 poly(A)tail5 Cap5 CappXT7pGEMT7Promoter茁-globin fromhuman茁-globin fr
25、omhumanHA genePoly(A)T7Promoter茁-globin fromXenopus laevis茁-globin fromXenopus laevisHA genePoly(A)检测细胞计数后,将HEK293T细胞以1伊106个/孔铺于6孔细胞培养板,待细胞融合度为80%时,利用LipofectamineTM3000 将 mH7-YN-pGEM 和 mH7-YN-pXT7分别以1 滋g/孔6 滋g/孔转染HEK293T细胞。转染细胞24 h后利用4%多聚甲醛固定、1%BSA溶液封闭;以鸡源H7亚型(CK/YN/SD024/2021)HA单因子血清(1颐100)作为一抗,FI
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