多杀性巴氏杆菌毒素中保护性抗原肽的筛选.pdf
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1、第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202204022中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine多杀性巴氏杆菌毒素中保护性抗原肽的筛选Vol.45,No.12Dec.2023王怡涤,庞碧寒,宋吉健,关丽君,薛云,司丽芳12,赵战勤1,2(1.河南科技大学动物科技学院/洛阳市动物细菌性传染病防控技术重点实验室,河南洛阳47 10 0 3;2.河南科技大学动物科技学院/兽医生物制品工程实验室,河南洛阳47 10 0 3)摘要:为筛选产毒素多杀性巴氏杆菌(T*Pm)亚单位
2、疫苗的优势保护性抗原,本研究根据多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)的结构和功能区将其编码基因toxA分为1个全长片段和7 个子片段(N端2 个、C端5个),设计相应引物,分别经PCR扩增后克隆至pET-28a载体中构建各重组质粒,分别利用原核表达系统,诱导表达后经SDS-PAGE和Westernblot检测各重组蛋白的表达情况和反应原性。SDS-PAGE结果显示,正确表达了全长蛋白rPMT,N端rPMT-N1和rPMT-N2,以及C端rPMT-C3r PM T-C 7 共8 个重组蛋白;各蛋白的表达量占菌体总蛋白的6.2 9%33.74%,其中rPMT以可溶性形式表达,rPMT-C5以可溶性和包涵体
3、两种形式表达,其他6 个重组蛋白均以包涵体形式表达。Western blot结果显示,8 个重组蛋白均具有一定的反应原性,其中PMT C端的重组蛋白rPMT-C3、rPMT-C4、r PM T-C6 和rPMT-C7的反应原性较强。因此,分别制备上述PMTC端4个重组蛋白的ISA201佐剂疫苗,分别对小鼠进行2 次免疫,并分别在小鼠首免前和二免后14d采血、分离血清,通过rPMT-ELISA方法检测各组小鼠的抗体水平;分别以4个不同致死剂量(LDi)的天然PMT对各组小鼠进行腹腔攻毒,统计各重组蛋白制备的亚单位疫苗对小鼠的攻毒保护率。rPMT-ELISA结果显示,二免后各重组蛋白免疫组小鼠的几
4、何平均抗体效价分别为1:445、1:37、1:7 3和1:2 56。攻毒试验结果显示,ISA201佐剂对照组和PBS对照组小鼠均于攻毒后2 4h内全部死亡;rPMT-C6疫苗的保护效力最强,4个攻毒剂量对小鼠的免疫保护率均为10 0%(4/4);其次是rPMT-C7疫苗,除最高剂量(56 LDioo)攻毒组死亡1只小鼠外,其他组小鼠均全部存活;rPMT-C3和rPMT-C4疫苗的保护力较弱,在3LDio0和15LDioo攻毒剂量时对小鼠的保护率均为10 0%,在30 LDi0和56 LDi0o攻毒剂量时对小鼠的保护率分别为25%(1/4)和0。本研究经原核系统表达了PMT全长片段及7 个子片段
5、(N端2 个、C端5个),首次证实PMTC端重组蛋白rPMT-C6和rPMT-C7具有作为亚单位疫苗保护性抗原的潜力,该结果为T+Pm亚单位疫苗的研发提供了参考依据。关键词:产毒素多杀性巴氏杆菌;toxA;多杀性巴氏杆菌毒素;表达;保护效力中图分类号:S852.61文献标识码:A文章编号:10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 7 9-0 8Screening of protective antigenic peptides ofPasteurella multocida toxinWANG Yi-di,PANG Bi-han,SONG Ji-jian,GUAN Li-jun,
6、XUE Yun,SI Li-fang2,ZHAO Zhan-qin!.2*(1.Laboratory of Veterinary biologics Engineering,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Luoyang Key Laboratory of Prevention and Control Technology of Zoonotic Bacterial Infectious Diseases,Coll
7、egeof Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)*Corresponding author收稿日期:2 0 2 2-0 4-15基金项目:国家自然科学基金项目(32 0 7 2 8 99);中牧实业股份有限公司开放科研课题(ZM20200526)作者简介:王怡涤(1997-),女,河南禹州人,硕士研究生,主要从事家畜传染病及其疫苗研究.*通信作者:E-mail:z h a o z h a n q i n 12 6.c o m1280中国预防兽医
8、学报2023年Abstract:In order to screen the dominant protective antigens of toxin-producing Pasteurella multocida subunit vaccine,P.multocida toxin(PMT)was designed into 1 full-length fragment and 7 sub-fragments(2 N-terminal and 5 C-terminus)based onthe structure and functional region of PMT.The BL21/pE
9、T28a system was used for recombinant expression,and the expressionand reactogenicity of each recombinant protein were detected by SDS-PAGE and western blot assays.The results of SDS-PAGEshowed that a total of 8 recombinant proteins including the full-length protein toxA,N-terminals rPMT-N1 and rPMT-
10、N2,and 5C-terminal proteins rPMT-C3-rPMT-C7 were correctly expressed.Their expression amount accounted for 6.29%-33.74%of thetotal bacterial protein,among which toxA was expressed in soluble form,rPMT-C5 was expressed in both soluble form andinclusion body,and the other six recombinant proteins were
11、 expressed in inclusion body.Western blot results showed that all eightrecombinant proteins showed a certain degree of reactogenicity,among which the recombinant proteins rPMT-C3,rPMT-C4,rPMT-C6 and rPMT-C7 at the C-terminus of PMT had strong reactogenicity.ISA 201 adjuvant vaccines of four recombin
12、antproteins at the C-terminal of PMT were prepared respectively,and the mice were immunized twice.Blood was collected before thefirst immunization and 14 days after the second immunization and serum was separated.The antibody levels of mice in each groupwere detected by rPMT-ELISA.Mice were intraper
13、itoneally challenged with four different lethal doses(LDoo)of natural PMT,andthe challenge protection rate of each group was calculated.The results of rPMT-ELISA showed that the geometric average antibodytiters of mice in the recombinant protein immunization group after the second immunization were
14、1:445,1:37,1:73 and 1:256,respectively.The results of challenge test showed that all mice in the ISA201 adjuvant control group and PBS control group diedwithin 24 hours after challenge;the rPMT-C6 vaccine had the strongest protective efficacy,with a protection rate of 100%(4/4)atthe four challenge d
15、oses;followed by the rPMT-C7 vaccine,which protected all the mice except for one in the challenge groupwith the highest dose(56LDioo).The protection of rPMT-C3 and rPMT-C4 vaccines was weak,with 100%protection at both 3LDio0and 15LDioo challenged doses,and 1/4 and 0 protection rates at 30LDioo and 5
16、6LDioo challenged doses,respectively.This studyrecombinantly expressed and purified the PMT full-length fragment and 7 sub-fragments(2 N-terminal fragments,5 C-terminalfragments),and confirmed for the first time that the PMT C-terminal recombinant proteins rPMT-C6 and rPMT-C7 have thepotential to se
17、rve as subunit vaccine protective antigens,thus providing a reference for the development of subunit vaccines againsttoxin-producing Pasteurella multocida.Key words:toxigenic Pasteurella multocida;toxA;Pasteurella multocida toxin;expression;protective efficacy产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurellamultocid
18、a,T+Pm)与其他巴氏杆菌的主要区别是其能产生一种不耐热的皮肤坏死毒素,称为多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PM T)。产毒素多杀性巴氏杆菌主要感染猪和反动物1-3,偶尔也感染兔、犬、家禽和人类4。在猪群中,产毒素多杀性巴氏杆菌的感染能导致猪发生进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PA R),该病以鼻甲骨萎缩、鼻梁变形和生长迟缓为主要特征。PMT是PAR发生过程中产生的必要毒力因子,单独接种天然或重组的PMT就能复制出PAR的典型临床症状和病理变化5。因此,PMT被认为是一种有意义的亚单位疫苗抗原因子6 。
19、但是,天然PMT仅占菌体总蛋白的0.6%左右,产量很低且难于纯化和灭活7 。因此,通过截短毒素抗原基因制备重组PMT是研制产毒素多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的有效途径。PMT属于细菌A-B毒素家族中的皮肤坏死毒素18 ,由噬菌体toxA基因编码,该基因38 55bp,编码12 8 5个氨基酸,蛋白分子量为146 ku。PM T 的N端(aalaa505)为细胞受体结合区域,与同家族大肠杆菌的细胞毒性坏死因子CNF1(Cytotoxic necrotizing factor 1)和CNF2具有一定的同源性6.9。PMT的C端(aa506aal285)包含C1、C2 和C33个结构域。C1结构域(aa
20、575a a 7 2 0)的作用是通过与脂质体结合定位于细胞膜上;C2结构域(aa720a a l10 5)由2 个或折叠子域组成,其具体功能尚不清楚;C3结构域(aal 106a a l 2 8 5)是PMT的催化活性区域,可以激活钙信号通路和有丝分裂信号通路,从而发挥生物毒性作用10 。本研究以产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6株的基因组DNA为模板,对toxA基因的不同片段进行克隆表达,并通过western blot鉴定其反应原性,将其制备为亚单位疫苗,并对小鼠进行免疫攻毒试验,为PMT保护性抗原片段的筛选以及亚单位疫苗的研发奠定基础。第12 期王怡涤,等.多杀性巴氏杆菌毒素中保护性抗原肽的
21、筛选12811材料与方法1.1主要实验材料96 只56 周龄SPF级雌性KM小鼠购自河南省实验动物中心。产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6株、大肠杆菌DH5、BL2 1感受态细胞、pET-28a载体等,均由河南科技大学兽医生物制品工程实验室保存。猪PMT抗血清由本实验室通过将产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6株感染猪后制备。TSA、TSB培养基购自美国BD公司;LB(胰蛋白陈、酵母粉)培养基购自OXOID公司;PrimeSTAR?Max高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司;His标签蛋白纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司;DNA胶回收试剂盒、质粒提
22、取试剂盒等购自生工生物工程基因名称(nt)Gene name(nt)toxA(1-3855)toxA-N1(1-750)toxA-N2(1-1218)toxA-C3(1372-2958)toxA-C4(2194-3855)toxA-C5(1372-3855)toxA-C6(2956-3855)toxA-C7(2509-3837)toxA-N(aal-aa505)NtoxA-N1(aal-aa750)RtoxA-N2(aal-aa1218)R2F3toxA-C5(aa1372-aa3855)toxA(aal-a3855)图1toxA分段克隆策略Fig.1The strategy of toxA
23、segmented cloning1.3重重组表达载体的构建及鉴定利用DNA凝胶回收试剂盒回收各PCR产物,经双酶切(酶切位点参考表1)后分别克隆至pET-28a表达载体中,构建8 个(上海)股份有限公司;硝酸纤维素膜(NC膜)购自武汉博士德生物工程有限公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(IgG-HRP)购自Proteintech公司。1.2引物的设计合成及toxA基因的PCR扩增参考GenBank中登录的产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因(CP003313.1),利用生物学软件TMHMM2.0预测PMT信号肽和跨膜区(https:/services.healthtech.dtu.dk/se
24、rvice.php?TMHMM-2.0)后采用Primer5.0设计8 对引物(表1)。提取产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6株的基因组DNA为模板,采用各引物和高保真DNA作聚合酶分别经PCR扩增toxA基因全长片段和7 个子片段(图1),对扩增产物采用凝胶电泳检测后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。表1本研究中所用引物Table 1The PCR primers used in this study引物序列(5-3)产物/bpPrimer sequence(5-3)ProductsF1:GCGGATCCATGAAAACAAAACA3855R4:CTGAGCTCTTATAGTGCTCTTG
25、TTAAGCF1:GCGGATCCATGAAAACAAAACAR1:GCAAGCTTGTATCCATAGATATCTAGF1:GCGGATCCATGAAAACAAAACAR2:GCAAGCTTTGCTGGTACTAACATATCF3:GTGGATCCATTTCGGAAACCGCAGAAR3:ATGTCGACCAGAAGCTTTCTGAAAGCF4:GTGGATCCGGTGCGATTCCAGAGGCAR4:CTGAGCTCTTATAGTGCTCTTGTTAAGCF3:GTGGATCCATTTCGGAAACCGCAGAAR5:ATGAGCTCTTATAGTGCTCTTGTTAAGCGAGF5:GT
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