DNA条形码技术在法庭科学中的应用 (1).pdf

中国人民公安大学学报(自然科学版)2023 年第 4 期 No.4 2023Journal of People蒺s Public Security University of China(Science and Technology)总第 118 期 Sum118DNA 条形码技术在法庭科学中的应用刘佳俊,摇 易少华(华中科技大学同济医学院法医学系,湖北武汉摇 430030)摘摇 要摇 种属鉴定是非人源生物检材鉴定的重要检验内容。传统形态学方法对鉴定人员能力水平和检材质量条件要求较高,鉴定能力有限。基于 DNA 序列多态性的 DNA 条形码技术具有巨大的种属鉴定潜力,通过比对生物基因组中普遍存在且变异水平适中的短 DNA 序列实现高效、准确的种属鉴定,目前已在法医昆虫学鉴定等法庭科学实践中得到应用。介绍了 DNA 条形码技术的研究进展及其在法庭科学中的应用价值,旨在为非人源生物检材鉴定提供新的研究思路。关键词摇 种属鉴定;DNA 条形码;非人源生物检材;法庭科学中图分类号摇 D918郾 9文献标志码摇 AApplications of DNA Barcoding Technology in Forensic MedicineLIU Jiajun,摇 YI Shaohua(Department of Forensic Medicine,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)Abstract:Species identification is a crucial part of identification of non鄄human biological materials.Tra鄄ditional morphological methods have high requirements on the ability level of the examiners and the quali鄄ty of materials,resulting in limited discrimination.DNA barcoding technology based on DNA sequencepolymorphism has enormous potential for species identification.The efficient and accurate species identi鄄fication has been achieved by comparing short DNA sequences that are prevalent in biological genomesand have moderate levels of mutation,and this technology has been successfully used in forensic scientificpractices like entomology identification.The research progress of DNA barcoding technology and its appli鄄cation values in forensic science are introduced,aiming to provide new research concepts for the identifi鄄cation of non鄄human biological materials.Key words:species identification;DNA barcode;non鄄human biological materials;forensic science收稿日期摇2023鄄07鄄10第一作者简介摇刘佳俊(2000),男,湖南衡阳人,在读硕士研究生。研究方向为法医遗传学。通信作者摇易少华(1979),男,博士,副教授。研究方向为法医遗传学。E鄄mail:0摇 引言非人源生物样本已成为法庭科学中重要的证据来源。种属鉴定是非人源生物样本的重要检验内容。传统方法通过识别样本的形态特征实现种属鉴定,但对鉴定人员能力及样本条件均有较高要求。近年来,DNA 条形码技术迅速发展,在非人源生物样本鉴定领域展现了巨大的应用潜力。理论上由 n 个碱基组成的 DNA 片段存在4n种序列可能,即便考虑自然选择导致部分碱基固定等情况,一段较短的 DNA 序列也完全足以鉴别所有物种1。DNA 条形码是生物中普遍存在且变异水平适中的短 DNA 片段。DNA 条形码技术通过比对分析目标样本的 DNA 条形码实现种属鉴定,对鉴定人员301刘佳俊等:DNA詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬条形码技术在法庭科学中的应用的经验要求相对较低,不受物种发育阶段影响,相较于传统形态学方法更加便捷、更加准确2。目前,DNA 条形码技术已被应用于法庭科学领域非人源生物样本的鉴定,在法医昆虫学鉴定等方面发挥的作用越来越重要。本文将对 DNA 条形码技术的研究进展及在法庭科学上的应用现状进行介绍,为今后 DNA 条形码技术的法庭科学应用研究提供参考。1摇 DNA 条形码1郾 1摇 常用 DNA 条形码理想条形码应满足以下标准3:(1)容易获得,即条形码上下游序列高度保守便于设计通用引物,目标序列短便于后续扩增与测序;(2)通用性好,尽可能以一段条形码鉴别更多的物种;(3)变异水平适中,种内变异水平的最大值应小于种间变异水平的最小值。1郾 1郾 1摇 动物 DNA 条形码动物种属鉴定的常用条形码主要来自于线粒体DNA 上的细胞色素 C 氧化酶亚基 I(cytochrome coxidase I,COI)基因、细胞色素 b(cytochrome b,Cytb)基因,相较核 DNA 具有拷贝数量多、不易降解、易于扩增和物种间进化速度快等优势。2003年,Hebert 等2率先提出了建立以 COI 基因序列多样性为基础的动物物种鉴定系统。COI 是线粒体呼吸链复合物 IV 中由线粒体 DNA 编码的三个亚基之一,其编码基因5忆端长约650 bp 的片段具有通用引物稳定、变异水平适中等优势2。在除刺胞动物门外的11 个动物门的 13 320 个物种编码中,COI 基因在98%的物种种内变异程度不到 2%,但在种间的平均变异却高达 11郾 3%4。此后的多项研究均证明了COI 基因在哺乳动物5-7、鱼类8-9、昆虫10-12等动物种属鉴定中的有效性。Cytb 是线粒体呼吸链复合物 III 的组分之一,已有大量研究证明利用 Cytb 基因的通用引物能实现多种动物的种属鉴定13-14。1郾 1郾 2摇 植物 DNA 条形码植物基因组的遗传变异情况相较动物更复杂15:(1)植物线粒体编码基因进化速率较慢;(2)植物种类繁多且倍性复杂;(3)植物杂交现象普遍,不同类群基因组间存在遗传物质交流。目前高等植物的常用条形码主要为叶绿体 DNA 编码基因核酮糖 1,5鄄二磷酸羧化酶(ribulose鄄1,5 bisphosphate car鄄boxylase,rbcL)基因、成熟酶蛋白 K(maturase K pro鄄tein,matK)基因,叶绿体 DNA 非编码间隔区 trnH鄄psbA 序列,以及核 DNA 内转录间隔区 2(internaltranscribed spacer region 2,ITS2)序列16。rbcL 是植物光合作用的关键酶,其扩增引物通用性较强,但其基因序列的进化速率较慢;matK 是参与植物内含子剪切的成熟酶,其编码基因进化速率较快,但引物通用性较差;trnH鄄psbA 序列包括两端的 trnH 基因、psbA 基因及二者间隔段,其引物通用性好且进化速率快,但其内部大量的插入/缺失区域使得序列分析较为困难15。因此,在种属鉴定中应用条形码组合比用单个通用条形码更加可行,亦可根据鉴定需求选择不同识别能力的条形码进行研究,如多级可拆卸条形码组合 rbcL 基因(科级)+matK 基因(属级)+trnH鄄psbA(种级)3。2009 年,生命条形码 联 盟(Consortium for the Barcode of Life,CBOL)植物工作组将 rbcL 基因与 matK 基因的组合作为陆地植物的核心条形码序列17。ITS2 序列是真核生物中介于5郾 8SrRNA 基因和 28SrRNA 基因间的核 DNA 序列,能为植物种属鉴定提供除叶绿体外的遗传信息18-19。第三届 DNA 条形码国际学术大会建议进一步评估变异速率更快的 ITS 序列和 trnH鄄psbA 序列。CBOL 中国植物工作组分析了 1 757 种共 6 286个种子植物样本的 matK 基因、rbcL 基因、trnH鄄psbA序列和 ITS2 序列,发现 ITS2 序列鉴别种子植物的通用性强、分辨率高,建议将其作为种子植物的核心条形码20。1郾 1郾 3摇 微生物 DNA 条形码微生物种类繁多,难以筛选理想条形码21。真菌的 COI 基因存在较多内含子,影响其扩增效率22。Santamaria 等23发现 ITS 序列在真菌主要类群中引物通用性强、变异水平适中、长度合适,且适用于下一代测序技术(Next Generation Sequen鄄cing,NGS)。2011 年,第四届国际生命条形码大会正式推荐将 ITS 序列作为真菌的首选条形码。在细菌等原核微生物条形码研究中,16S rRNA 基因较为常见21,24。此外还有学者以流感病毒血凝素裂解位点基因为条形码,实现了 A 型流感病毒部分亚型的鉴定25。1郾 2摇 DNA 条形码技术流程DNA 条形码检验的技术流程主要包括:样本采集、DNA 提取、目标条形码选择、PCR 扩增、测序、参考数据库选择、比对分析、结果录入等26,如图 1所示。401刘佳俊等:DNA詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬条形码技术在法庭科学中的应用图 1摇 DNA 条形码检验的技术流程摇检验人员应采集数目足够、具有一定代表性的样本,根据采集信息和样本信息制作标签,并尽快对样本进行预处理,随后妥善保存。磁珠法可用于常规样本的 DNA 提取,但对于降解检材可更改提取策略以保障提取质量,目前不同提取策略已发展出大量商业化提取试剂盒。检验人员可根据样本类型选择常用条形码,使用多种条形码共同分析有利于细分物种、提高种属鉴定的准确性,此外针对降解检材可选择微条形码。针对目标条形码设计引物后,对样本进行 PCR 扩增,不断优化 PCR 参数,得到足够的条形码扩增产物。若样本来源单一,扩增产物经Sanger 测序即可得到条形码序列;若样本来源多个物种,则应使用 NGS 技术,实现对不同物种来源的条形码的平行扩增。选定参考数据库对条形码进行比对分析,常用的 DNA 条形码数据库有 GenBank、BOLD,针对特殊样本还存在药用材料 DNA 条形码数据库等专用数据库。杨倩倩等27总结了遗传距离分析、遗传相似度分析、系统发育树分析、序列特征分析、统计方法分析共 5 种条形码分析方法。其中遗传距离分析法使用 K2P(Kimura 2鄄parameter)模型,通过分析两序列间碱基差异得出遗传距离,从而比较种内与种间的遗传差异性,以此判断条形码间隙、实现区分物种。遗传距离分析法的阈值标准通常采用“十倍原则冶,即变异率小于 1%为同一物种,而种间变异率为种内变异率 10 倍以上。然而,不同物种具有不同阈值,种间种内也可能存在阈值重叠现象,因此难以设定统一的阈值。以上样本标签信息、引物序列、DNA 条形码序列等数据均应被上传至数据库中,促进数据库的进一步完善。1郾 3摇 DNA 微条形码和 DNA 宏条形码技术为了提高条形码序列的检验效率,基于 DNA 标准条形码发展出 DNA 微条形码和宏条形码技术。DNA 微条形码针对降解检材,采用类似于 miniSTR的设计策略,以标准条形码核心变异序列为目标,设501刘佳俊等:DNA詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬条形码技术在法庭科学中的应用计引物扩增更短的条形码序列片段,从而提升扩增及测序成功率。大量研究表明从毛干5、高温高压加工的食品6与药品26,28等降解检材中扩增的微条形码能提供足够种属鉴定序列信息。宏条形码是扩增非单一物种来源的检材而产生的混合条形码产物,需要借助 NGS 技术分析混合样本的条形码序列。Coghlan 等29利用 DNA 宏条形码技术检测 15个混合样本的 16S RNA 基因为条形码,成功鉴定出其中未被标明的生物样本成分。DNA 宏条形码与微条形码联用甚至可以分析降解混合检材30。2摇 DNA 条形码技术在法庭科学中的应用2郾 1摇 动物 DNA 条形码应用2郾 1郾 1摇 法医昆虫学鉴定法医昆虫学是 DNA 条形码技术在国内法庭科学的最早应用领域。传统形态学方法难以鉴定昆虫幼虫、易混淆近缘种,而 DNA 条形码技术仅需少量DNA 样本即可轻松解决这些难题31。陈庆等10采用 COI 基因为条形码实现了北京地区7 种嗜尸性蝇类 77 个样本的种属鉴定。杨立等11以 COI 基因为条形码实现了 14 省 38 只嗜尸性蝇类样本的种属鉴定。2郾 1郾 2摇 野生动物鉴定野生动物的立法范围在各国不尽相同,动物检材的种属来源成为了野生动物法庭科学中的主要问题。面对传统形态学无法鉴别的野生动物肉块、皮毛等检材,DNA 条形码技术可有效地实现种属鉴定。Kumar 等7以 COI 基因为条形码实现了7 种印度鹿的 31 份组织样本的种属鉴定。另有研究报道应用 DNA 微条形码技术还可对犀牛角、穿山甲鳞片等野生动物的降解检材进行种属鉴定。另外,在野生动物伤人案中,通过分析伤人动物的种属信息不仅能为抓捕行动提供线索,还有助于后续制定预防策略。Oury 等9以 COI 基因为条形码成功鉴定出两起鲨鱼伤人案中创口 DNA 样本均来源于牛鲨。2郾 2摇 植物 DNA 条形码应用2郾 2郾 1摇 硅藻检验硅藻常作为生物标记解决水尸死因、死亡时间、落水点等问题。然而,硅藻的种群体量庞大、种间形态差异微小、且具有形态可塑性,即便是形态学专家也难以准确鉴定其种属来源。Li 等32针对长江流域南京段的 10 份水中硅藻样本采用形态学方法与DNA 条形码技术进行了种属鉴定,结果表明 DNA条形码技术相较于形态学方法鉴定成功率更高,且适用于形态学方法无法鉴定的种群。Liu 等33比对分析 16S RNA 基因、18S RNA 基因、ITS 序列、COI基因、rbcL 基因等条形码及其相应的 23 对扩增引物,最终推荐 18S RNA 基因、rbcL 基因及与其相应的 3 对引物 18S605、Baci18S、BacirbcL 用于硅藻检验。2郾 2郾 2摇 致伤物调查交通事故中,擦碰处的 DNA 检材或许能成为案件的突破口。雷湘华等34报道了一起相关案例:一辆三轮车可能被另一农用车上木材擦碰导致侧翻,因此分别对三轮车碰撞处的树皮物质与农用车所拉木材进行种属鉴定,结果表明树皮来源于柑橘,而木材来源于界山三角枫,凭此排除了木材擦碰导致三轮车侧翻的可能。因此,DNA 条形码技术也可用于推断生物类致伤物的种属来源。2郾 2郾 3摇 尸源调查花粉随人的呼吸进入体内并被细胞吞噬,最终随细胞死亡而钙化,而花粉中的遗传物质由于细胞壁等的保护作用得以保存,可利用 DNA 条形码技术分析花粉的种属信息,结合其地理分布特征即可推断死者生前居住地。刘萌妍等35以 rbcL 基因与matK 基因为条形码,从无名男尸肺组织中鉴定出了27 科 31 属 32 种花粉,结合其地理分布信息从而推断该尸体生前应长期居住于两广、云南、海南等地区。2郾 3摇 微生物 DNA 条形码应用特殊土壤微生物能用于调查尸体特别是某些高度白骨化尸体的死后间隔时间(postmortem interval,PMI),还能用于判断尸体是否被移动以及尸体移动前的掩埋地点。Procopio 等24以 16S RNA 基因为条形码研究了 4 具腐烂猪尸体死后 6 个月内土壤微生物群落的演变,发现埋尸土壤中变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门明显增多以及酸杆菌门明显减少,且确有与 PMI 相关的特殊菌类,同时两个月时尸体附近土壤微生物丰度减少、部分菌类即便在 6 个月后仍然未恢复如初。2郾 4摇 其他2郾 4郾 1摇 食物、药物、毒物鉴定近年食品、药品掺假事件频发,对这些掺入物进行监测不仅能提升食物药物的质量,还能明确掺入物的比例。然而,高温高压等加工过程会导致食品601刘佳俊等:DNA詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬条形码技术在法庭科学中的应用与药品的原有形态破坏而不适用形态学方法,DNA也会降解而难以扩增完整条形码,而利用 DNA 微条形码技术能实现这些降解检材的种属鉴定28。励炯等6建立了 18 种动物熟肉的掺假模型,以 COI基因为条形码分析了不同掺假模型中掺入熟肉的最低检出比例。相较于掺假事件,食品药品安全问题可能直接威胁人的生命。有毒动植物难以在受害者的呕吐物和排泄物中保持完好形态,此时 DNA 条形码技术能根据其中残留的 DNA 实现种属鉴定。Nithaniyal等36以 rbcL 基因为条形码为 100 种有毒植物构建了 DNA 条形码参考数据库,结果表明 rbcL 基因在属水平上的鉴定成功率为 100%,在种水平上鉴定成功率为 89%(剩余 11%均为近缘种)。因此,面对使用有毒动植物自杀、投毒的案件,办案人员可将 DNA 条形码技术作为常规毒物分析的辅助手段。2郾 4郾 2摇 外来物种鉴定除了监测野生动植物走私外,DNA 条形码技术在海关监测中的主要应用便是防止物种入侵。介壳虫类昆虫等37农林害虫及刺萼龙葵等38入侵杂草能够破坏内地生物多样性,严重威胁正常的农业生产活动、造成巨大经济损失。此外,境外输入的传染病病原菌更是会威胁到国民生命健康25,39。我国进出口货物量随着贸易全球化而逐年增加,这加重了海关部门的监测任务。相对于限制众多的形态学方法,更准确、更迅速、样本及人员要求更低的 DNA条形码技术更能满足海关监测的需求40。4摇 总结展望本文分别描述了动物、植物、微生物种属鉴定中的常用 DNA 条形码及 DNA 条形码检验的技术流程,并基于具体案件类型展现 DNA 条形码技术在法庭科学领域中的广阔应用前景。未来相关研究需要针对不同物种筛选具体的理想条形码,寻找合适的条形码组合,提升条形码适用范围和识别能力。同时,DNA 条形码技术的标准化及参考数据库也是重要研究内容。考虑到地理因素产生的种内种间序列差异,需要不断补充地方样本序列来建立一个完整的条形码数据库。随着相关研究的深入,DNA 条形码技术将促进人源证据与非人源证据整合,使得不同物种来源的检材都能实现其证据价值。参考文献1摇 肖金花,肖晖,黄大卫.生物分类学的新动向 DNA条形编码J.动物学报,2004,50(5):852-855.2摇 HEBERT P D,CYWINSKA A,BALL S L,et al.Biologicalidentifications through DNA barcodesJ.Proceedings Bi鄄ological Sciences,2003,270(1512):313-321.3摇 任保青,陈之端.植物 DNA 条形码技术J.植物学报,2010,45(1):1-12.4摇 HEBERT P D N,RATNASINGHAM S,DEWAARD J R.Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit 1 di鄄vergences among closely related species J.ProceedingsBiological Sciences,2003,270(1):96-99.5摇 夏皙,丁梅.CO玉基因微条形码技术在毛发种属鉴定中的应用 J.法医学杂志,2016,32(6):441-443+454.6摇 励炯,江海,吴琼,等.基于 COI 序列的 DNA 微条形码技术鉴别熟肉制品中 11 种肉掺假的研究J.食品工业科技,2021,42(2):99-104.7摇 KUMAR V P,SHUKLA M,RAJPOOT A,et al.DNA bar鄄coding as a tool for robust identification of cervids of Indiaand its utility in wildlife forensicsJ.Mitochondrial DNAPart B,2018,3(1):250-255.8摇 RASMUSSEN R S,MORRISSEY M T,HEBERT P D N.DNA barcoding of commercially important salmon andtrout species(Oncorhynchus And Salmo)from North A鄄mericaJ.Journal of Agricultural and Food 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