基因综合项目工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用.doc
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1、基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中应用一、 课程设计目 理解工业生产中新型育种技术并比较不同育种技术优势;学习理解基因工程育种技术及其操作原理;研究基因工程育种技术在人干扰素生产中创新。二、 课程设计题目描述与规定本文简介一种二十世纪七十年代发展起来一种新型生物技术基因工程,简介其在育种中应用。文中重点简介了基因工程育种普通环节,以及近年来浮现运用基因工程进行定向育种重要新技术:基因定点突变,易错PCR,DAN重排及基因组重排。之后,应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b,通过优化补料分批培养时葡萄糖流加方略,提高了hIFNa2b表达量和表达速率。不同葡萄糖流
2、加方式有各自长处,采用恒速流加葡萄糖方式,hIFNa2b表达量达到6 540 mg/L,高于当前已知文献中hIFNa2b最高表达量5 200 mg/L。三、课程设计报告内容引言基因工程是二十世纪七十年代发展起来一种新型生物技术,其发展从主线上变化了生物技术研究和开发应用模式。1972年美国Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV 40DNA、噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年,美国斯坦佛大学Cohen和Boyer等人在体外构建出具有四环素和链霉素连个抗性基因重组质粒分子,将之导入大肠杆菌后,该重组质粒得以稳定复制,并赋予受体细胞相应抗生素抗性,由此宣布了基因工程
3、诞生。在二十世纪八十年代以来,随着大批大批成果浮现及应用,基因工程带来了一场新革命。运用这些技术,可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物遗传性状。通过转入外源基因,微生物和动、植物细胞可以产生出自身本来没有蛋白质。同样,运用重组DNA技术,也可以使某些本来存在量极低但有重要工业或医学用途小分子(抗生素)或蛋白质之外大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术完善和发展,以基因水平为核心当代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家关注,并展示了良好应用前景。1、基因工程育种基因工程育种是在基因水平上,运用人为办法将所需某一供体生物遗传物质提取出来,在离体条件下用恰当工具酶进行切
4、割后,与载体连接,然后导入另一细胞,使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引,与前几种育种技术相比,基因工程育种技术是人们在分子生物学指引下一种自觉、能像工程同样可预先设计和控制育种新技术,它可实现超远缘杂交,因而是最新最有前程一种育种新技术。基因工程技术所有过程普通涉及目基因DNA片段获得、DNA片段与基因载体体外连接、外源基因转入宿主细胞和目的基因表达等主要环节。1.1 基因工程育种普通环节是:(1)目基因获得:普通通过化学合成法、物理化学法(涉及密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法(逆转录法)、Norther杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法、编码序
5、列富集(磁珠捕获)、产物导向法、Nod连接片段筛选法、外显子捕获法及外显子扩增法、剪接位点筛选法、作图克隆法、杂交细胞克隆法、消减杂交法、相似序列克隆法、差别显示逆转录PCR法、显微克隆与微克隆法和插入诱变法等办法获得目基因。(2)载体选取:基因工程载体重要是质粒和病毒,载体普通为环状DNA,其规定有自我复制能力、分子小、拷贝数多、易连接和易筛选等特点。(3)重组子体外构建:重要办法有粘性末端连接法、平端连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法。(4)重组载体导入受体细胞:其重要途径有转化、转导、显微注射、电穿孔法、迅速冷冻法和炭化纤维介导法等。(5)重组体筛选和鉴定:以适当筛选办法选取具备最
6、佳性能突变重组子,重组体筛选和鉴定重要通过表型法、DNA鉴定筛选法,选取性载体筛选法、分子杂交选取法、免疫学办法和mRNA翻译检测法等办法来实现。1.2 运用基因工程进行定向育种新技术12.1 基因定点突变定点突变(sitespecific mutagenesis或sitedirected mutagenesis)是指在目DNA片断(例如:一种基因)指定位点引入特定碱基对技术,其涉及寡核苷酸介导定点突变、盒式诱变以及以PCR为基本定点突变。近十年来,定点突变技术获得了长足发展,并且在此基本上又发展了诸多新技术。例如:重叠延伸PCR法(Overlap Extension PCR简称EOPCR)、
7、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重叠延伸PCR(OnestepOverlap Extension PCR,简称OOEPCR)、单管大引物PCR(Singletube Megaprimer PCR)、迅速定点诱变法、多位点环状诱变法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定点诱变技术。在这些技术中,单管大引物PCRTAMS定点诱变技术最为简朴和合用,并得到广泛应用。单管大引物PCR Picard等和HKe等分别建立了单管大引物PCR法。该法省去了老式上以PCR为基本定点突变中第1轮PCR产物纯化过程,实现了在同一管中先后进行2
8、轮PCR反映定点突变目的。在上述2组研究者建立办法中,后者提出方案更加巧妙、简朴(图1)。其只需设计Tm值不同2个侧引物,在第1轮PCR反映中用Tm值低侧引物(F1)和诱变引物,在较低退火温度下进行扩增反映,产生大引物;然后再加入Tm值高侧引物(F2),在较高退火温度下进行第2轮反映,扩增出含突变位点整个DNA产物。Ke等在此办法中还提出了2条更为细致、有效改进办法,使PCR产物最后产量和纯度均有所提高。这2条改进办法为:(1)在第1轮PCR反映中,诱变引物浓度仅为侧引物1,以减少诱变引物在第2轮PCR中干扰作用;(2)在第l轮PCR反映后,亦即第2轮PCR反映前,增长5个循环不对称扩增,这有
9、助于提高其后扩增效率。这种单管大引物法长处是:实现了在同一管中先后进行2轮PCR反映,大幅简化了操作环节,并且省时、省力。在对各种样品进行操作时,该办法长处更为突出。在以PCR为基本诱变办法中,该法是引入单位点突变最简朴、最经济办法。图1 单管大引物PCR过程Figure 1 The process of Singletube megaprimer PCRTAMS定点诱变技术 ,Young等报道了一种有目地扩增突变链定点诱变技术(Targeted amplification of mutant strand,TAMS)。该技术可以一次引入各种位点突变,并且可以有目地扩增突变链,从而使突变效率几
10、乎达到100。该办法重要分3步(图2):(1)线性单链DNA模板制备:通过线性PCR制备单链DNA模板;(2)突变链合成:该环节需用2个锚锭引物(即Anchor5和Anchor3)和各种诱变引物(Mut1和Mut2)。(3)有目地扩增突变链:设计扩增引物(PCR5和PCR3),使其3端碱基分别与锚锭引物引入突变碱基配对,扩增引物只能退火到突变链而不是亲本链。在多位点突变实验中,TAMS诱变技术应当是首选办法。定点突变技术已在蛋白质构造和功能改造上获得了很大成功。例如,运用定点突变变化酪氨酰-tRNA合成酶活性中心,从而使酶活力提高了50倍;此外,在T4溶菌酶中加入二硫键,明显提高了该酶稳定性。
11、图2 TAMS定点诱变技术原理和操作过程Figure 2 The principle and operation process of TAMS12.2 易错PCRDNA聚合酶在进行扩增目DNA时会以一定频率发生碱基错配,这一现象正好提供了一种对特定基因进行随机诱变也许办法。运用PCR过程中浮现碱基错配进行特定基因随机诱变技术就称为易错PCR(Error_prone PCR,简称EPPCR)。此办法原理与操作如图3,其操作过程是在Taq DNA聚合酶催化PCR反映体系中,运用Mn代替天然辅助因子Mg,使Taq DNA聚合酶缺少校对活性,同步使反映体系中各种dNTP比例失衡,因而导致碱基错配率大
12、大增长,普通约为0.1。此外,还可以在该反映体系中加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种办法可以将错配率最大提高至20。孔荣等运用易错PCR使D-海因酶对底物水解活性提高了2.4倍;黄瑛等用易错PCR使短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍,Km值由8.24mmol/L减少至7.717mmol/L,在pH8.0时稳定性也较野生型脂肪酶有所提高。图3 易错PCR示意图Figure 3 Sketch of error-prone PCR12.3 DAN重排DNA重排(DNA shufling)技术是一种运用重组文库体外定向进化技术,Stemmer于1993年一方面提出。DN
13、A重排基本原理是一方面将同源基因(单一基因突变体或基因家族)切成随机大小DAN片段,然后进行PCR重聚。那些带有同源性和核苷酸序列差别随机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板,通过多次PCR循环后能迅速产生大量重组DNA,从而创造出新基因。其操作原理和环节如图4。图4 DNA重排原理及操作环节Figure 4 The principle and operation process of DNA shufflingZhao等在此基本上创造了一种更加简化交叉延伸程序( STEP)(图5)。此技术是在一种PCR反映体系中以2个以上有关DNA片段为模板进行PCR反映。引物先在一种模板链上延伸,随之进
14、行多轮变性、短暂复性(延伸)过程。在每一轮PCR循环中,那些某些延伸片段可以随机地与含不同突变模板进行杂交,使延伸继续,并由于模板转换而实现不同模板间重组,这样重复进行直到获得全长基因片段,重组限度可以通过调节时间和温度来控制。此办法省去了将DNA酶切成片段这一步,致使DNA重排办法进一步简化。图5 交叉延伸程序基本过程Figure 5 Basic procedure of staggered extension process近几年来,提高DNA重排技术捕获变异能力始终是研究人员努力方向。Ostermie等以核酸外切酶代替DNaseI对靶序列进行消化,创造了递减法建立杂交酶技术(ITCHY)
15、,使得非同源性序列间也能发生重排,扩大了该技术用途。Hiraga等开发SISDC技术在组件内部引入了限制性内切酶辨认标记,用相应限制性内切酶代替DNase I产生重排片段。Bergquist等开发DOGS技术则是依照保守模体区序列特性设计简并引物,扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。由于此办法是在突变耐受保守区直接增长转辙组几率,因此其产生突变频率大大增长。DNA重排最大特点是在重复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要过程,并且其对可操作靶序列长度没有任何规定,可以达到几万kb。通过多轮筛选或选取,可以使有益突变迅速积累,导致功能明显提高,同步还打破了老式物种之间由于生殖隔离导致
16、不能重组界限。12.4 基因组重排基因组重排(genome shufling)技术是受DNA重排启发,于2l世纪浮现全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化对象从单个基因扩展到整个基因组,可以在更为广泛范畴内对菌种目性状进行优化组合。一方面,运用典型诱变育种技术获得具有目的性状基因组库,然后运用原生质体融合技术将这些发生正向突变菌株全基因组进行多轮随机重组,从而迅速筛选表型得到较大改进杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术,将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生),即递归原生质体融合(recursive protoplast fusion)办法。Zhang
17、等于初次报道应用基因组重排办法迅速地使弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)产生泰乐菌素能力得到提高。该办法以营养缺陷型为出发菌株,仅用了1年时间,通过两轮基因组改组就从24 000株菌株中分离到2组共14株泰乐菌素高产菌株,其泰乐菌素产量高于通过典型诱变育种办法所筛得生产菌株SF21,而后者(SF21)是用典型诱变育种办法在长达时间中先后筛选过约1 000 000个菌株后才获得。由此可见,此技术大大减少了工作量,并缩短了筛选时间。四川抗菌素工业研究所徐波等以产量性状为标记特性,应用基因组重排办法在一年之内使替考拉宁产量提高了65.3。除上述技术外,近年来又浮现了某些新技术,例
18、如:某些基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简并引物基因改组(DOGS)、瞬时模板随机嵌合、单向引物随机重组、自我复制、体外随机引起重组(RPR)、酶法体外随机-定位诱变(randomsitedirected mutagenesis)、交错延伸剪接PCR等。2、基因工程育种技术在大肠杆菌种应用大肠杆菌是迄今为止研究最为详尽原核细菌,其K-12MG1655株4 000多kb染色体DNA已测序完毕,全基因共具有4 405个开放阅读框,其中大某些基因生物功能已被鉴定。作为一种成熟基因克隆表达受体,大肠杆菌被广泛用于分子生物学研究各个领域,如基因分离扩增、DNA序列分析、基因表达产物功能
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