褐藻胶多糖分子修饰酶的研究进展_李丽.pdf

LI Li，et al：Research Progress of Alginate Polysaccharide MolecularModifying EnzymesJOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023ReviewResearch Progress of Alginate Polysaccharide Molecular Modifying EnzymesLI Li1，NING Limin2，YAO Zhong1，ZHU Benwei*1，XU Hong1（1.College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China；2.School ofMedicine and Holistic Integrative Medicine,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China）Abstract：As a linear polysaccharide,alginate has different physiological and biochemicalcharacteristics according to its structure and composition.It holds great application value andpotential in food,medicine and cosmetics.These characteristics of alginate are mainly controlled bythe action of alginate-modifying enzymes such as alginate lyase,mannuronan C5-epimerase,alginateacetylase and alginate deacetylase.This review mainly introduced the synthesis of alginate-modifyingenzymes and the mechanism of alginate modification,and summarized the source,classification,structure,mode of action and research progress of several alginate modifying enzymes.The emphasiswas laid on the research progress of alginate lyase and mannuronan C5-epimerase.And we alsoprospected the future development of related research,providing reference for the furtherdevelopment and application of alginate and its related modifying enzymes.Keywords:alginate polysaccharide,alginate modification,alginate lyase,mannuronan C5-epimerase摘要：褐藻胶作为一种线性多糖根据其结构和组成差异具有不同的生理生化特性，在食品、医药和化妆品等领域有着巨大的应用价值和潜力。褐藻胶的这些特性主要通过褐藻胶修饰酶如褐藻胶裂解酶、甘露聚糖C5差向异构酶、褐藻胶乙酰化酶和褐藻胶脱乙酰化酶的作用控制。作者主要概述了褐藻胶修饰酶合成和修饰褐藻胶的作用机理，总结了几种褐藻胶修饰酶的来源、分类、结构、作用方式和研究进程，重点阐述了褐藻胶裂解酶和甘露聚糖C5差向异构酶的相关研究进展，并对相关研究的未来发展提出展望，可为进一步开发和应用褐藻胶及其相关修饰酶提供借鉴和参考。关键词：褐藻胶多糖；褐藻胶修饰；褐藻胶裂解酶；甘露聚糖C5差向异构酶中图分类号：Q 55文章编号：1673-1689（2023）01-0018-22DOI：10.3969/j.issn.1673-1689.2023.01.002褐藻胶多糖分子修饰酶的研究进展李 丽1，宁利敏2，姚 忠1，朱本伟*1，徐 虹1（1.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京210009；2.南京中医药大学 医学院整合医学学院，江苏 南京210023）收稿日期：2022-04-28基金项目：国家自然科学基金项目（31601410）；江苏省博士后科研资助计划项目（51208364）；宿迁市科技计划项目（L201906）。*通信作者：朱本伟（1987），男，博士，教授，硕士研究生导师，主要从事酶工程研究。E-mail：综 述182023年第42卷第1期食品与生物技术学报李 丽，等：褐藻胶多糖分子修饰酶的研究进展综 述褐藻胶是一种由-D-甘露糖醛酸（-D-mannuronate，M）和-L-古 洛 糖 醛 酸（-L-guluronate，G）通过14糖苷键连接的线性多聚体1，根据其分子的长度、M/G残基比率和分布以及乙酰化程度等，使其具有凝胶强度、水合能力、黏度和生物活性等特性，在食品、医药和化妆品等领域有着巨大的应用价值。褐藻胶的这些特性主要通过褐藻胶修饰酶对褐藻胶的合成和修饰过程进行控制，为了能够利用不同的褐藻胶修饰酶进行高效、安全和绿色地制备具有不同性质的褐藻胶分子，作者旨在介绍褐藻胶修饰酶合成和修饰褐藻胶的作用机理，总结目前几种褐藻胶修饰酶的来源、分类、结构、作用方式和研究进展，为将来更好地应用褐藻胶修饰酶和开发褐藻胶的商业价值提供参考。褐藻胶根据残基的排列组合不同分成3种片段：聚甘露糖醛酸（poly-mannuronate，poly-M）片段、聚古洛糖醛酸（poly-guluronate，poly-G）片段和甘露糖醛酸-古洛糖醛酸（poly-MG）杂合段。poly-M和poly-G的链式结构非常相似，单糖组分的区别仅仅是C5上羟基位置的不同（见图1）1。图1不同结构褐藻胶的结构示意图Fig.1Structural diagram of alginate with differentstructures自然界中的褐藻胶主要是由褐藻、一些钙质红藻、假单胞菌属和固氮菌属的一些细菌产生的。目前的商业褐藻胶主要是从一些褐藻植物中提取，如泡 叶 藻（Ascophyllum）、公 牛 藻（Durvillaea）、昆 布（Ecklonia）、螺纹雷松藻（Lessonia trabeculata）、巨藻（Macrocystis）和马尾藻（Sargassum）等2。不同来源褐藻胶的组成和结构不同，例如螺纹雷松藻和极北海带（Laminaria hyperborea）中的褐藻胶古洛糖醛酸含量较高（M/G残基比率50rNitAly深海热液喷口70热稳定性在50 的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中孵育72 h后，可保留49.0%的初始活性在90 时的产物产量比40 时高18倍，在没有底物的条件下AMOR_PL17A能够在60 下稳定24 h在67 条件下孵育30 min后活性仍保留50%，即使在100 条件下处理30 min后仍旧残留10%的活性参考文献929394到目前为止有关褐藻胶裂解酶耐热机制的相关研究还较少，根据已有报道，rNitAly的热稳定性与Cys80和Cys232之间形成的二硫键有关94。来自Cobetia sp.NAP1的AlgC-PL7的热稳定性可能与-螺旋有关95。Yang等对AlyM进行保守结构域重建，去除F5_F8_type_C结构域后，在45 下孵育1 h的热稳定性由保留30%40%的酶活力提升到了保留大约70%的酶活力96，经截断后的突变体具有比全酶更紧凑的结构，能更好地抵抗热变性的影响，证明酶的热稳定性也可能与酶的结构紧凑程度有关。在低温条件下进行酶促反应可以减少能耗、降低微生物污染的风险和终止催化反应的难度，一般的耐冷性褐藻胶裂解酶在低于35 时具有最高的催化活性，并通常在20 时保留最高活性的50%57。表3中列举了3种具有良好低温稳定性的褐藻胶裂解酶。表3典型的耐冷褐藻胶裂解酶Table 3Typical cold-adapted alginate lyaseAlyw201Vibrio sp.W230AlyC3Psychromonas sp.20在低温10 和20 下，催化活性分别为最高活性的72.9%和38.4%在1 下保持其最高活性的48.2%5797酶来源最适温度/低温稳定性参考文献Alg2951Alteromonas portusHB16171825在低于30 的温度下有很好的稳定性47对于大多数褐藻胶裂解酶来说，催化的最适pH接近中性，并且只在狭窄的pH范围内表现出较高活性，也有一些酶在狭窄的pH碱性条件下表现出最高活性。只有少数酶在较宽的pH范围内表现出较高活性。例如来自Vibrio sp.NJ-04的AlgNJ-04裂解酶在pH 4.010.0的宽pH范围内保留了超过80%的 活 性，表 现 出 优 异 的pH稳 定 性 98。而Alyw201在pH 5.010.0孵育12 h后仍保留超过70%的活性。特别是在检测到的整个pH范围（pH3.011.0）中，孵育12 h后仍保留超过40%的活性57。另外，来自Pseudoalteromonas carrageenovoraASY5的Alg82399、Vibrio sp.SY01的Aly08100、Serratia marcescens NJ-07的AlgNJ-07101、Paeniba-cillus sp.LJ-23的Algpt37等均具有良好的pH稳定性。从海洋环境中分离出的褐藻胶裂解酶通常还25LI Li，et al：Research Progress of Alginate Polysaccharide MolecularModifying EnzymesJOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023Review具有盐活化这一特性，即在一定浓度的氯化钠溶液中，褐藻胶裂解酶的活性增加数倍，反映了它们对海水环境的适应能力。如在1 mol/L NaCl条件下，AlgM4的活性增加了约7倍102；AlyPM其活性在0.51.2 mol/L NaCl条件下可以增加6倍103；而对于来自Vibrio sp.的A9mT在0.4 mol/L NaCl条件下其活性增加了24倍104。尽管到目前为止已经发现了很多褐藻胶裂解酶可以被盐激活，但是其中的激活机制并没有被彻底揭示出来。根据已有报道，AlgNJ-04的盐活化特性是由于褐藻胶分子中结合水的去除或褐藻胶-酶复合物形成过程中的电荷效应98。AlgM4的二级结构中-螺旋和-折叠的含量被NaCl改变从而增强了其对底物的亲和力和抵抗热变性的能力102。AlyPM的盐活化特性也是由于在NaCl存在时其对底物亲和力增强，但是结构并不发生变化103。AlyC3的盐活化机制则是因为保留了二聚体四元结构97。总之，目前对褐藻胶裂解酶的基础研究依然主要集中在新型褐藻胶裂解酶的表征、酶学性质分析以及对酶的三级结构分析，而为了更好地利用褐藻胶裂解酶进行工业化生产，需要进行更多的研究来揭示褐藻胶裂解酶催化机制。2.6褐藻胶裂解酶的应用褐藻胶裂解酶的应用包括褐藻胶寡糖的制备、原生质体分离、肺囊性纤维化病的治疗以及褐藻胶测序等方面。1）褐藻胶寡糖的制备褐藻胶寡糖相对分子质量小，具有多种生物活性。褐藻胶寡糖的制备方式包括酸解、热解和酶解等。Iwamoto等比较了酸解和酶解制得的褐藻胶寡糖对肿瘤坏死因子TNF-的诱导活性，结果证明酶解得到的褐藻胶寡糖具有更加广泛的生物活性105。根据Belik等报道通过褐藻胶裂解酶降解天然的聚甘露糖醛酸，产生的甘露糖醛酸寡糖可用于协同治疗肿瘤106。2）原生质体分离褐藻胶是褐藻细胞壁中含量最丰富的成分，除此还有岩藻糖胶、纤维素、多酚和蛋白质等物质。研究表明多酚与褐藻胶网络相连从而进一步加强细胞壁的强度107。采用纤维素酶和褐藻胶酶混合的方法可以降解褐藻细胞壁，释放原生质体108。3）肺囊性纤维化病的治疗褐藻胶裂解酶能够配合一些抗生素降解肺囊性纤维化病人肺中病原菌产生的褐藻胶，使病原菌的细胞壁通透性增强，利于抗生素发挥抗生作用109。Patel等开发了环丙沙星-褐藻胶裂解酶功能化壳聚糖纳米颗粒（AgLase-CIPR-CH-NPs）用于有效治疗肺囊性纤维化患者铜绿假单胞菌感染110。4）褐藻胶测序核磁共振是表征褐藻胶分子最常见的一种方法，然而其只能得出G残基和M残基的统计分布，利用具有特殊底物特异性以及作用模式的酶来降解褐藻胶，再结合一些现代分析方法如质谱等对褐藻胶片段进行表征能够进一步测量片段长度分布28。5）生物燃料的制备褐藻因其高生长速率和高糖分含量而被认为是生物燃料乙醇生产中的可再生生物质。由于缺乏木质素，褐藻生物质的糖化相对容易。但是传统的工业微生物无法代谢褐藻胶，经代谢工程改造的微生物生产的外切型褐藻胶裂解酶可以有效利用褐藻胶，以此克服了该问题111。Wang等优化了两种重组褐藻胶裂解酶（内切型Alg7D和外切型Alg17C）的酶促糖化过程，以便从褐藻胶中高效生产DEH，而DEH是利用褐藻生物质生产生物燃料的关键底物112。2.7提高褐藻胶裂解酶的应用能力目前针对褐藻胶裂解酶的应用能力，主要是通过酶的固定化和酶的分子改造提高酶活性或者改善某种特性，大大提高了酶的工业化应用效率。为了发挥酶的最大应用价值，近年来研究人员证明了固定化酶在稳定性、可重复利用性和易于分离方面显示出比游离酶更好的优势，酶可以通过吸附、包埋和交联进行固定化。目前对固体载体上固定褐藻胶裂解酶已经进行了一些研究，例如生物聚合物微球、超滤膜、壳聚糖纳米颗粒、介孔氧化钛颗粒等，为褐藻胶寡糖的生产、工业废水的处理以及抗生物膜治疗等方面提供了褐藻胶裂解酶应用的途径25，83。作者所在课题组将褐藻胶裂解酶AlyPL6固定在介孔氧化钛颗粒（MTOPs）上后，在重复使用10次后，在45 下保留55.4%的活性113。Li等将褐藻胶裂解酶Aly08固定在低相对分子质量壳聚糖纳米颗粒上，与游离的Aly08相比，固定化的AL-LMW-CS-NPs在抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成和阻断成熟的生物膜方面表现出更高的效率，使得铜绿假单胞菌的生物量大大减少。该研究促进了褐藻胶裂解酶作为抗生物膜剂的进一步发展114。而262023年第42卷第1期食品与生物技术学报李 丽，等：褐藻胶多糖分子修饰酶的研究进展综 述甘露聚糖C5差向异构酶3Meshram等将AlgL固定在醋酸纤维素超滤膜上，成功地解决了多糖结垢问题对水净化的影响115。酶的分子改造主要包括合理设计、半理性设计、定向进化、保守结构域重组和非催化结构域截断116，经过分子改造后的突变体具有与初始酶不同的酶学特性。作者所在课题组系统总结了褐藻胶裂解酶分子改造的研究进展117，目前常以引入二硫键、重建保守结构域以及定向进化来提高酶的活性和稳定性。例如，Yang等在对cAlyM的催化位点、二级结构以及空间构型进行综合分析后，在分子中引入了二硫键，设计出了突变体D102C-A300C和G103C-T113C，t1/2（45）分别增加了2.25、1.16 h118。作者所在课题组研究发现褐藻胶裂解酶Aly7B在35 下表现出较差的热稳定性。然而，当截断Aly7B-CDI（非催化结构域：R2Y181）时，Aly7B-CDII（催化结构域：W190H477）在35 下活性可以保持不变119，热稳定性大大提高。Xu等通过在AlgL-CD的活性中心引入碱性氨基酸来合理设计酶分子以增加酶活性，其中突变体E226K的整体构象变得更加灵活，与底物的亲和力增加，表现出比野生型AlgL-CD更高的酶活力，但同样由于钙结合环的灵活性变高，与Ca2+的结合能力变弱，E226K的热稳定性变差120。而Su等基于E226K的作用模式，选 择loop环1上 的I211位 点 和 底 物 入 口 处 的E276、Y292和R294位点作为工程靶点，设计出的突变体E226K/I211T/R294V催化裂隙周围的环更灵活、底物入口更大，酶的催化效率提高了4.78倍，半衰期t1/2（45）从89 min增加到557 min121。此外，分子改造还可以用于改造酶的最终产物，Zhang等报道了借助AlyF中间产物的裂解模式变化，对与糖结合的残基Arg266进行位点突变，改变亚位点对糖的亲和力，结果证明F128T/W172R/R226H突变体的主要产物由三糖（三糖占比为87.0%）变为二糖和三糖（二糖占比提高到40.5%）122。甘露聚糖C5差向异构酶（mannuronan C5-epimerase，MC5E）是一种褐藻胶修饰酶，催化褐藻胶中的-D-甘露糖醛酸（M）转化为C5同分异构体-L-古洛糖醛酸（G）。研究表明纯化后的一些MC5Es能在体外引入G片段，并进一步增加褐藻胶中的G残基含量，经验证AlgE2在特定的褐藻胶中将G残基相对含量从初始值（045%）提高到约70%123。而AlgE6和AcAlgE1甚至可以将G残基相对含量分别提高到78%和87%124。考虑到褐藻胶的理化性质和生物活性与G/M的含量有关，MC5E作为一种褐藻胶修饰酶是生产具有特殊性质的褐藻胶的重要工具酶。3.1甘露聚糖C5差向异构酶的来源及分类MC5Es有两个主要的来源：真核生物来源，包括褐藻、海带和昆布等；细菌来源，主要包括假单胞菌属（如荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌和门多萨假单胞菌）和固氮菌属（如圆褐固氮菌和棕色固氮菌）124。不同物种中的MC5Es具有不同的数量、类型和特征。MC5Es可分为Ca2+依赖亚型和Ca2+非依赖性亚型。例如丁香假单胞菌中的PsmE、圆褐固氮菌中的AcAlgE1以及棕色固氮菌中AlgE17的酶活性取决于Ca2+的存在，而丁香假单胞菌、棕色固氮菌、铜绿假单胞菌中的周质AlgG可以在无Ca2+条件下高效地将甘露糖醛酸转化为古洛糖醛酸125。对于依赖Ca2+的MC5Es来说，Ca2+参与中和异构化反应中甘露糖醛酸的电荷，而在丁香假单胞菌中的Ca2+非依赖型周质AlgG中一些特殊的氨基酸，如Arg345，也可以执行同样的功能126。MC5Es也可以分为单功能和双功能MC5Es。例如棕色固氮菌中的AlgE2和AlgE7都具有差向异构酶活性和裂解酶活性，在存在Ca2+（3.3 mmol/L）的情况下，AlgE2可以修饰褐藻胶并使其链中的糖苷键发生断裂，具体表现为催化后的褐藻胶平均相对分子质量下降和整个褐藻胶溶液的黏度下降123。同样，AlgE7也具有与AlgE2相同的双功能且其裂解酶活性高于AlgE2127。Gawin等也在2020年从棕色固氮菌中鉴定出3种褐藻胶修饰酶，其中AcAlgE2和AcAlgE3具有裂解酶和异构酶活性，且在体外条件下只显示出裂解酶活性128。来自铜绿假单胞菌的AlgG不仅具有异构酶活性，而且还能保护褐藻胶不被降解129。来自丁香假单胞菌中Ca2+依赖的PsmE会催化褐藻胶中的M残基的异构化和O-乙酰水解125。3.2甘露聚糖C5差向异构酶的结构及催化机制棕色固氮菌产生的7种分泌性差向异构酶（AlgE17，AlgEs）结构特征已经研究清楚，AlgEs由两个不同的蛋白质模块组成，包括一个或两个A模27LI Li，et al：Research Progress of Alginate Polysaccharide MolecularModifying EnzymesJOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023Review块（约385个氨基酸）和17个R模块（约150个氨基酸）123。每个AlgE都有一个独特的A和R模块的序列、数量和分布（见图8），每个胞外AlgE的最后一个R模块通常都有一个参与酶分泌的非结构化多肽130。含有与褐藻胶和Ca2+结合位点的A模块可以进行异构化反应和确定最终的异构化反应模式131。而R模块不具有异构化活性，主要通过降低催化反应对Ca2+浓度的要求，使A模块的催化活性提高了约10倍132。除此之外，具有9个氨基酸序列的47个重复的R模块参与了酶的分泌和Ca2+的结合130。丁香假单胞菌的PsmE具有与AlgEs相似的A和R模块，同时还具有额外的M区、N区和RTX区。M区和RTX区都是参与Ca2+的结合，而N区是一种乙酰化酶125。此外，圆褐固氮菌中的AcAlgE1、AcAlgE2和AcAlgE3具有与AlgEs相同的模块结构35。图8MC5Es的模块结构Fig.8Module structure of MC5Es研究人员通过核磁共振方法确定了AlgE4的结构，AlgE4的A模块折叠成一个右手平行-螺旋，由4个平行的-折叠组成，包括12个完整的匝数133。突变体实验证明，Tyr149、Asp152、His154和Asp178是AlgE4活性的关键残基，甘露糖醛酸的质子化羧基可以与Asp152（或Asp178）形成氢键，Tyr149作为催化碱提取与C5结合的质子，质子化的His154作为催化酸贡献一个质子对C5进行亲核攻击，最后形成古洛糖醛酸133。R模块形成了一个右手平行的-胶冻卷。根据计算，A模块可以结合11个糖醛酸残基，R模块可以结合5个残基134。AlgE4的 结 构 模 型 可 以 用 于 更 好 地 理 解 其 他AlgE17结构。Wolfram等解释了来自丁香假单胞菌的AlgG的分子结构，它折叠成右手平行-螺旋，有11个完整的线圈和一个不完整的线圈，其中线圈410形成一个碳水化合物结合域或糖类水解结构域126。研究表明，褐藻胶裂解酶和甘露聚糖C5差向异构酶的催化机制是相似的133，裂解反应和异构化反应都涉及3个步骤，两者均需要中和羧基上的负电荷，并催化提取C5位上的质子，两者的反应机理差异发生在最后一步，对于裂解酶来说，最后一步是糖苷键的断裂，同时在C4和C5之间形成双键，离开的基团发生质子化形成一个新的还原端。而甘露聚糖C5差向异构酶需要一个氨基酸残基，该残基能够从吡喃糖环的另一侧向C5提供一个质子，形成C5差向异构体。AlgG和AlgE4的A模块的整体结构与一些-螺旋结构的褐藻胶裂解酶（PL6、PL31家族）在结构上有相似之处，然而使用Dail进行蛋白质结构比较结果表明，它们之间没有任何可能表明共同进化起源的序列同源性，并且这些褐藻胶裂解酶的催化残基在AlgE4中的A模块中并不保守133。异构酶AlgE4中的A模块的催化位点更类似于褐藻胶裂解酶A1-III（PL5家族）和ALY-1（PL7家族），ALY-1和A1-III的底物结合裂缝中心的4个催化残基（Gln/Asn、His、Arg和Tyr）在反应机理中起着关键作用。AlgE4中的A模块的活性位点Asp152、His154、Lys117和Tyr149也显示出相同的空间排列，并且甘露糖醛酸三糖以与A1-III中结合的三糖非常相似的方向和位置结合。尽管4个活性位点氨基酸残基的位置相似，但是其他重要残基（尤其是Asp178）和亚位点-2和-3的环境非常不同。AlgG与AlgE4的活性位点结构非常相似，活性位点的主要区别在于AlgE4不包含与AlgG中发现的Arg345相当的残基，而是包含参与形成AlgE4中Ca2+结合位点的几个酸性残基。正如在大多数-螺旋褐藻胶裂解酶中所发现的那样，这种Ca2+在反应过程中能够中和糖醛酸的羧酸基团，从而发挥与Arg345相当的作用126。依赖Ca2+的褐藻胶裂解酶和282023年第42卷第1期食品与生物技术学报李 丽，等：褐藻胶多糖分子修饰酶的研究进展综 述AlgE4通过Ca2+中和糖醛酸上的负电荷，而不依赖Ca2+的褐藻胶裂解酶和AlgG则使用一个精氨酸残基来完成这个反应135。在第二步催化中，精氨酸或赖氨酸通常作为裂解酶的催化碱基，而去质子化的His319能 够 从 甘 露 糖 醛 酸 的C5中 提 取 质 子，His319很可能在AlgG的催化反应中起催化碱基的作用。那么，水分子在AlgG的催化过程中充当催化酸，这也与前文中提到的一些具有-螺旋结构的褐藻胶裂解酶也有水分子作为催化酸的结论一致126。对于双功能酶AlgE7，Gaardlos等解释了两种活性如何相互调节的结构基础，首先异构酶和裂解酶活性具有相同的催化位点，这两种活性通过不断改变褐藻胶链而相互影响，并且产物的形成高度依赖于酶作用于哪种底物。当使用明确的底物poly-M和poly-MG时，裂解酶优先的裂解位点为MXM和GXM（X为G或M）。其中H154在反应中充当催化碱，Y149充当催化酸，而突变体R148G几乎失去了所有裂解酶活性，但保留了异构酶活性，因此推测R148会影响Y149将质子提供给糖苷键或糖环的另一侧136。3.3甘露聚糖C5差向异构酶的作用方式关于MC5E作用方式的报道较少，相关报道主要集中在棕色固氮菌中的AlgE家族，目前已经提出两种反应模式，即优先攻击模式和渐进作用模式137。在优先攻击模式中，酶优先攻击邻近G残基中的M残基，并在每次差向异构化反应后脱离底物138。而在渐进作用模式中，由于甘露糖醛酸之间通过-1，4糖苷键连接，每个残基相对于其相邻残基旋转近180，因此酶和多糖链相对移动，使得下一次异构化反应可以在酶与底物不解离的情况下完成138。有研究报道了AlgE4的渐进作用模式，酶沿着底物链进行滑动，每隔一个残基进行一次异构化，不需要发生旋转。即底物封闭在一个相对较大的凹槽中，并且在活性位点的每一侧都有一个夹子，该夹子封闭了聚合物并帮助其滑动137。而丁香假单胞菌中的AlgG也遵循渐进作用模式，这也是为什么假单胞菌中的褐藻胶出现M和G交替的原因126。此外，AlgE2和AcAlgE1遵循优先攻击模式进行反应，并且与底物的组成和钙离子的浓度有关126，128。而其余的AlgEs都是根据优先攻击模式或者两种机制的组合进行反应132。由于反应模式的不同，不同的AlgEs异构酶所产生的产物也不同。根据报道，AlgE1具有两种不同的催化结构域，一种产生poly-G，一种产生poly-MG139，AlgE2和AlgE5主要产生短的poly-G140，PsmE、AlgE6和AcAlgE1主要产生长的poly-G140，AlgE4主要产生poly-MG141。人们可以利用该产物特点获得不同类型的褐藻胶低聚糖。3.4甘露聚糖C5差向异构酶的酶学特性目前已经表征的大多数异构酶的最适pH在6.58.0，最适温度范围为3040 124。据报道，来自Pseudomonas mendocina sp.DICP-70的PmC5A作为裂解酶和异构酶时的最适pH分别为8.0和9.0，是目前最适pH最高的酶142。金属离子影响酶活力，当Na+浓度为100200 mmol/L时，AlgE1活性最高124。对于AlgE2，Ca2+浓度为0.58 mmol/L时，初始反应速率随Na+浓度的增加而增加，当Ca2+浓度达到3.3 mmol/L时，Na+对异构化反应没有促进作用，而当Na+浓度达到约20 mmol/L时，对异构化反应有抑制作用143。对于双功能酶AlgE7，较高的Na+浓度可降低裂解酶活性并增加poly-G的形成，而高Ca2+浓度则提高裂解酶活性并减少poly-G的形成136，因此，可以通过调节Na+与Ca2+浓度来调节AlgE7的裂解酶活性与异构酶活性，获得目标产物。研究人员还证明在某些情况下Sr2+可以代替Ca2+，但酶的活性明显降低144。3.5甘露聚糖C5差向异构酶的应用MC5E作为一种褐藻胶修饰酶，能够增加底物的G残基含量，将褐藻胶或褐藻胶寡糖升级为具有长poly-G或poly-MG的产品，该类型的产品表现出优良的机械性能和独特的生物活性，可以应用于制备药物释放材料、用作抗菌剂、促进角质细胞增殖等方面。1）制备具有优异机械性能的材料 富含G的褐藻胶分子可以通过与一些二价离子结合而形成热稳定的三维凝胶网络，形成的凝胶145具备一定的刚性和机械强度，具有低收缩、高孔隙率146、高稳定性和高交联密度等特点。用MC5E调节褐藻胶分子中的G残基含量从而制备具有优异机械性能的材料是一种较为简单、可控和节能的方法。2）制备应用于药物释放的褐藻胶褐藻胶是输送药物的理想材料。药物扩散过程的速度主要与褐藻胶分子的孔隙大小有关，研究表明，poly-G含量较高的褐藻胶分子具有更开放的孔隙结构，表现出29LI Li，et al：Research Progress of Alginate Polysaccharide MolecularModifying EnzymesJOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023Review较高的扩散能力。而富含M的褐藻胶分子是软的，多孔性较差，并且随着时间的推移容易脱胶147。因此，富含G的褐藻胶能够更好地保护药物不被破坏，使其达到特定的位置并最大限度地发挥药效。3）增强褐藻胶寡糖的抗菌活性 富含G的褐藻胶寡糖可以通过与细胞表面的结合来分解生物膜，影响表面电荷，导致微生物的聚集，并通过阻止微生物移动来影响致病微生物的活性并增强抗生素的效果，因此M/G残基比率低的褐藻胶寡糖表现出突出的抗菌活性并可以用来制备抗菌剂148。4）制备促进角质细胞增殖的褐藻胶寡糖褐藻胶和褐藻胶寡糖也可以应用于治疗脱发症，因为它们不仅可以作为凝胶基质嵌入和装载活性成分，还可以促进角质细胞增殖。其中，具有由末端还原的poly-MG组成的褐藻胶寡糖组分是角质形成细胞生长最有效的激活剂149。细菌中的褐藻胶在O2/O3位上发生乙酰化，增加了自身的水合能力和黏度，有助于聚合物作为保护膜靠近细菌并阻碍免疫细胞的运动，同时乙酰化还使褐藻胶裂解酶无法作用于M残基，从而保护褐藻胶不被裂解成褐藻胶寡糖。然而到目前为止还没有发表过详细的褐藻胶乙酰化机制。4.1褐藻胶乙酰化机制初步分析目前对铜绿假单胞菌中乙酰化褐藻胶的生物合成途径及相关基因已经基本了解，研究表明AlgI、AlgJ和AlgF形成一个多蛋白质复合体，并借助Alg8和AlgX形成的分泌多蛋白质复合体与包膜上的褐藻胶发生聚合作用，进行褐藻胶的O-乙酰化反应过程。虽然AlgI、AlgJ和AlgF不是褐藻胶合成蛋白质复合体的一部分，但它们是褐藻胶乙酰化所必需的，Chanasit等也通过实验证明了这一点150。AlgI是一种膜结合型O-乙酰基转移酶，其从未知的细胞质乙酰基供体通过细胞质膜转移乙酰基，而AlgJ附着在内膜上，将乙酰基转移到AlgX，AlgX是甘露聚糖O-乙酰化酶，包含一个碳水化合物结合模块，能够将M残基乙酰化151。研究表明乙酰化程度高的褐藻胶的异构化程度较低152，原因可能是乙酰化酶AlgX和周质异构酶AlgG均是修饰酶复合体的一部分，可以看做是多糖底物的固定化酶，两者均能够结合M残基并进行修饰反应，但目前尚不清楚两种酶在与褐藻胶的结合上是否存在竞争关系126。4.2研究乙酰化机制的意义高乙酰化褐藻胶具有的黏度高、水合能力强、G残基含量低等特点使其在组织工程开发和再生医学中的水凝胶和支架以及含有生物活性胶囊化合物的伤口敷料等众多材料方面具有巨大潜力153。铜绿假单胞菌形成以乙酰化褐藻胶为主要成分的生物被膜，可以提高生物被膜的稳定性，从而有助于细菌抵抗恶劣的生存环境。同时相比于浮游细菌，生物被膜内的铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性提高了101 000倍，乙酰化褐藻胶是导致细菌耐药性和细菌免疫逃逸的主要原因154。因此研究褐藻胶的乙酰化机制对于治疗铜绿假单胞菌感染也具有重要意义。乙酰化的褐藻胶可以自发产生脱乙酰化，但在正常条件下反应缓慢，前文中提到，胞外甘露聚糖C5差向异构酶可以催化产生G，而这些酶不能催化已经乙酰化的残基，根据对AlgE4的晶体结构的分析表明这是由于空间位阻的限制，因此，为了获得高G含量的褐藻胶，需要对已经乙酰化的残基进行去乙酰化。目前还没有发现假单胞菌能够产生连续G残基的褐藻胶，但是人们在丁香假单胞菌中发现了一种分泌性甘露聚糖C5差向异构酶PsmE，该酶能够在体外催化生成连续的G残基聚合物，PsmE能够催化乙酰化底物进行差向异构化反应，是一种具有脱乙酰基和C5差向异构功能的双功能酶，使得菌株产生的褐藻胶具有较低乙酰基数量和较高G残基含量的特性125。尽管目前已经表征了大量的褐藻胶裂解酶，特别是对于来自海洋细菌中的酶，但对极端环境中的裂解酶知之甚少，一些新发现的褐藻胶裂解酶表现出的新颖的酶学性质和作用机制也没有得到清晰地解释。纵观近年来发表的关于褐藻胶裂解酶分子改造的相关文章，对酶的改造仍旧需要建立在对酶结构和作用机制分析的基础上。因此现下仍旧迫切需要筛选、克隆和表征新型褐藻胶裂解酶并解析其褐藻胶乙酰化4褐藻胶脱乙酰化酶5展 望6302023年第42卷第1期食品与生物技术学报李 丽，等：褐藻胶多糖分子修饰酶的研究进展综 述参考文献：1 VASUDEVAN U M，LEE O K，LEE E Y.Alginate derived functional oligosaccharides：recent developments，barriers，and futureoutlooksJ.Carbohydrate Polymers，2021，267：1-18.2 BIXLER H J，PORSE H.A decade of change in the seaweed hydrocolloids industryJ.Journal of Applied Phycology，2011，23（3）：321-335.3 SCHIENER P，BLACK K D，STANLEY M S，et al.The seasonal variation in the chemical composition of the kelp speciesLaminaria digitata，Laminaria hyperborea，Saccharina latissima and Alaria esculentaJ.Journal of Applied Phycology，2015，27（1）：363-373.4 WESTERMEIER R，MURUA P，PATINO D J，et al.Variations of chemical composition and energy content in natural andgenetically defined cultivars of Macrocystis from ChileJ.Journal of Applied Phycology，2012，24（5）：1191-1201.5 FRANKLIN M J，NIVENS D E，WEADGE J T，et al.Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides，alginate，Pel，and PslJ.Frontiers in Microbiology，2011，2：1-16.6 MAY T B，SHINABARGER D，BOYD A，et al.Identification of amino-acid-residues involved in the activity of phosphomannoseisomerase-guanosine 5-diphospho-D-mannose pyrophosphorylase-a bifunctional enzyme in the alginate biosynt