基于紫色杆菌素生物合成途径的L-色氨酸生物传感器的构建.pdf
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1、技术与方法生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):80-92收稿日期:20230323基金项目:国家自然科学基金面上项目(21878124)作者简介:李仁瀚,男,研究方向:代谢工程与合成生物学;Email:通讯作者:杨艳坤,男,博士,副教授,研究方向:分子生物学与合成生物学;Email:;李业,男,博士,助理研究员,研究方向:代谢工程与合成生物学;Email:基于紫色杆菌素生物合成途径的 L-色氨酸生物传感器的构建李仁瀚1,2 张乐乐1,2 刘春立1,2,3 刘秀霞1,2,3 白仲虎1,2,3 杨艳坤1,2,3 李业1,2,3(1.江南大学工业生物技术教
2、育部重点实验室,无锡 214122;2.江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心,无锡 214122;3.江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心,无锡 214122)摘 要:结合生物传感器进行高通量筛选是鉴定 L 色氨酸高产菌株的有力工具,但现有的 L 色氨酸生物传感器普遍存在工作范围和动态范围都较低的缺点。在大肠杆菌中表达紫色杆菌素生物合成途径,测试不同来源的 VioA 酶,结合 RBS 工程,开发了一种新型酶偶联 L 色氨酸生物传感器。测试发现来自 Chromobacterium violaceum 的 VioA 酶可使该传感器的检测上限扩大至 10 g/L 外源添加的 L 色氨酸;
3、将其 RBS 的初始翻译速率降低到约 2 000 时,传感器的动态范围扩大到 55 倍;通过肉眼可直观地区分 L 色氨酸产量不同的大肠杆菌菌株。这种新型的 L 色氨酸生物传感器可结合高通量筛选等手段,在鉴定 L 色氨酸及其高附加值衍生物高产菌株等方面发挥巨大作用。关键词:大肠杆菌;紫色杆菌素;L 色氨酸;生物传感器;RBS 工程DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230271Development of an L-tryptophan Biosensor Based on the Violacein Biosynthesis PathwayLI Renhan
4、1,2 ZHANG Lele1,2 LIU Chunli1,2,3 LIU Xiuxia1,2,3 BAI Zhonghu1,2,3 YANG Yankun1,2,3 LI Ye1,2,3(1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122;2.National Engineering Research Center for Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing,Jiangnan Univ
5、ersity,Wuxi 214122;3.Jiangsu Provincial Engineering Research Center for Bioactive Product Processing,Jiangnan University,Wuxi 214122)Abstract:Highthroughput screening combining with biosensors is a powerful tool for identifying highyield Ltryptophan producing strains,but current Ltryptophan biosenso
6、rs generally have the disadvantage of low operational and dynamic ranges.By expressing the violacein biosynthetic pathway in Escherichia coli and testing different sources of VioA enzyme and RBS engineering,a novel enzymecoupled Ltryptophan biosensor was developed.It was found that the VioA enzyme f
7、rom Chromobacterium violaceum expanded detection limit of the biosensor up to 0-10 g/L of exogenously added Ltryptophan.Reducing its translation initiation rate to approximately 2 000 expanded the dynamic range of the biosensor by 55fold.Different strains of E.coli with varying Ltryptophan yields co
8、uld be visually distinguished with the naked eye.This novel Ltryptophan biosensor can play a significant role in identifying highyield Ltryptophan and its highvalue derivatives producing strains through combining methods such as highthroughput screening.Keywords:Escherichia coli;violacein;Ltryptopha
9、n;biosensor;RBS engineering2023,39(10)81李仁瀚等:基于紫色杆菌素生物合成途径的 L-色氨酸生物传感器的构建L 色氨酸(LTryptophan,LTrp)是一种重要的芳香族氨基酸,在医药、食品、饲料等领域有着广泛的应用1-2,是许多高附加值化合物的前体,如吲哚 3 乙酸3和 5 羟色胺4等。主要用于工业化生产 L 色氨酸的工业底盘菌株通常为大肠杆菌5和谷氨酸棒杆菌6等。精准调控大肠杆菌的代谢途径可将碳通量转移到 L 色氨酸,如敲除编码色氨酸操纵子抑制因子的基因 trpR7,敲除编码色氨酸酶的基因 tnaA8,过表达 trpE、aroG9,抑制 PtaAck
10、A 途径10,平衡前体供应等11,L 色氨酸的生产已达到较高的产量、转化率和产率(titer,yield,Productivity,TYP)。例如,大肠杆菌菌株 TRP07 在 5 L 发酵罐补料分批培养中生产色氨酸的 TYP 分别为49 g/L、0.186 g/g 葡萄糖、2.8 g/(Lh)12。通过识别和修饰更多基因靶点,特别是那些与L 色氨酸代谢没有直接关系的基因,可进一步提高L 色氨酸的产量。然而,大肠杆菌中有数千个基因,其胞内代谢和调节途径十分复杂;另外精确定量 L色氨酸主要依赖液相色谱技术,需进行多轮繁琐、耗时且昂贵的测试才能鉴定出高产菌株13。但生物传感器辅助的高通量筛选能够在
11、代谢通路不明确的情况下识别新的基因靶标,成为代谢工程的补充策略,改造微生物工厂以提高其性能14,在合成生物学领域有着广泛的应用。进行高通量筛选的一个条件是生物传感器可将相关代谢物的浓度与易检测的信号相关联,如可见光、荧光或生长优势15。近年来研究人员已经开发了多种 L 色氨酸生物传感器,如基于核糖体开关的 p15ribo72716和基于 Rho 因子的 pSensor17。前者检测 L 色氨酸的动态范围为10.85 倍,工作范围为 0.2-10 mmol/L(0.04-2.04 g/L);后者检测 L 色氨酸的动态范围为 8 倍,工作范围为 0.1-1.5 mmol/L(0.02-0.3 g/
12、L),检测上限都较低。目前的工业 L 色氨酸菌株在摇瓶中很容易达到 2.1 g/L 的 L 色氨酸产量10,因此上述生物传感器可能不适合应用于工业菌株。紫色杆菌素是一种天然的双吲哚紫色色素,最初 从 Chromobacterium violaceum 中 分 离,后 续 在Duganella violaceinigra sp.、Janthinobacterium lividum、Collimonas CT、Psychrotrophic bacterium,XT1 中也陆续发现18。如图 1 所示,紫色杆菌素以两分子 L色氨酸为底物,以 VioABCDE19酶催化,经五步反应合成,并生成亮紫色副
13、产物脱氧紫色杆菌素。进一步研究20表明,脱氧紫色杆菌素仅在 VioABCE的参与下合成。由于紫色杆菌素及其衍生物具有抗菌、抗癌及抗病毒21-22等生物活性,目前其研究方向主要在于如何通过代谢工程利用微生物工厂提高其产量23-26。同时,由于紫色杆菌素和其中间体的颜色鲜艳,其生物合成途径也经常被用作合成生物学的验证工具18。红色的番茄红素27和淡黄霉素28都已被开发成相应的生物传感器,但关于将紫色杆菌素开发成生物传感器的研究却较少29,未见其作为 L 色氨酸生物传感器的报道。本研究对紫色杆菌素在大肠杆菌中的生物合成途径进行了全面表征,将其开发成 L 色氨酸生物传感器。通过 RBS工程对途径中第一
14、个酶 VioA 进行优化,并测试了来自不同的菌种的 VioA,开发了动态范围高达 55 倍的 L 色氨酸生物传感器,可检测到 0-10 g/L 的胞外供应的 L 色氨酸。这种新型的酶偶联生物传感器可结合高通量筛选技术,通过与出发菌株的颜色对比,高效鉴定出 L 色氨酸产量相对较高的大肠杆菌菌株,为提高 L 色氨酸及其高附加值衍生物的工业化产量做出贡献。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒、菌株与引物 本研究所用质粒列于表1,所用菌株列于表 2,所用引物列于表 3。所有基因合成、密码子优化、引物合成和测序服务均由苏州金唯智生物科技有限公司提供。1.1.2 试剂与设备 高速高保真 PCR 酶
15、PrimeSTAR Max DNA Polymerase 购自 TaKaRa Bio;质粒同源重组试剂盒 MultiF Seamless Assembly Mix 购自武汉爱博泰克有限公司。LB 培养基:10 g/L 蛋白胨,5 g/L 酵母抽提物,10 g/L 氯化钠。M9YE 培养基:17.1 g/L 十二水合磷酸氢二钠,3 g/L 磷酸二氢钾,0.5 g/L 氯化钠,1 g/L氯化铵,1 g/L 酵母抽提物,1 mmol/L 硫酸镁,0.1 mmol/L 氯化钙,10 g/L 葡萄糖及相应浓度的 L 色氨酸26。根据需要添加终浓度为 34 g/mL 的氯霉素或 50 g/mL 的卡那霉素
16、。以上所有试剂均购自上海生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.1082国药集团化学试剂有限公司。759S 紫外可见光分光光度计,上海棱光技术有限公司;Q5000 NanoDrop 紫外可见分光光度计,Quawell 公司。1.2 方法1.2.1 RBS 序列设计 本研究所使用的起始质粒pVio 的载体为 pRSFDuet,含有两个多克隆位点(multiple cloning site,MCS),来 自 Duganella sp.B2(Dug.B2)的 vioABCDE 基因簇被插在第二个多克隆位点上。每个多克隆位点前都有一个核糖体结合位点(ri
17、bosome binding site,RBS),依次命名为 RBSa和 RBSb。使用 RBS 计算器30在线网站 https:/ pBL_401 上的 Dug.B2_vioA的 RBSb 翻 译 起 始 速 率(translation initiation rate,TIR)约为 11 000(任意单位,arbitrary unit,au)。随后分别为 pBL_403-407 和 pBL_421-423 设计了 8 个RBSb 序 列;为 pBL_425、pBL_429、pBL_437-439设计了 5 个 RBSa 序列。所有质粒的 RBS 序列及其TIR 见表 4。1.2.2 质粒构建
18、与基因合成 敲除原核表达质粒pVio26上的 vioD 基因,并保留了其后 100 个碱基作为 vioE 可能的核糖体结合位点。以 pVio 为模板,用引物 401_F 和 401_R 进行扩增,得到线性化的 pBL_401,再采用同源重组法将线性化的质粒环化。同样,为替换 RBSb 序列,以 pBL_401 为模板,采用同样的方式构建质粒 pBL_403-407 和 pBL_421-423。以 Dug.B2 VioA(GenBank:ACT67682.1)为模 板,在 NCBI 上搜索其他物种的 VioA,并选择 21个 VioA 序列进行进一步分析。使用 MEGA7 构建系统发育树。最终选
19、择的 5 个 VioA 序列由 GENEWIZIPA:吲哚 3 丙酮酸;CPA:铬吡咯酸;VA:紫色杆菌酸;PVA:原紫色杆菌酸;PDVA:原脱氧紫色杆菌酸;DVA:脱氧紫色杆菌酸;Spont:自发反应IPA:Indole3pyruvic acid;CPA:chromopyrrolic acid;VA:violaceinic acid;PVA:protoviolaceinic acid;PDVA:protoviolaceinic acid;DVA:deoxyviolaceinic acid;Spont:spontaneous reaction图 1 紫色杆菌素生物合成途径Fig.1 Viola
20、cein biosynthetic pathway2023,39(10)83李仁瀚等:基于紫色杆菌素生物合成途径的 L-色氨酸生物传感器的构建(Suzhou,China)进行密码子优化并合成,分别替换Dug.B2_vioA,同时保留了原来的 Dug.B2_vioBCE。采用 Vector NTI 进行序列比对。以 pBL_401 为模板,获得 4 个 DNA 片段 415V、T7terA、T7terB 和 415_VioA,同源重组得 pBL_415。以 pBL_415 为模板,采用同样的方式构建质粒 pBL_416-420。部分质粒简图见图 2。为替换各自的 RBSa 序列,以 pBL_41
21、5、pBL_ 416 和 pBL_419 为模板,分别构建质粒 pBL_425、pBL_429 和 pBL_437-439。1.2.3 菌株培养 挑取单菌落,在 5 mL LB 培养基中以 37、220 r/min 的条件培养过夜。随后,将75 L 种子液接种到 24 孔板中,每孔含有 1.5 mL M9YE 培养液。在 37,220 r/min 下培养 2-3 h,当 OD600达到 0.8-1.0 时,加入终浓度为 0.1 mmol/L的 IPTG,调节温度至 30。本文中所有数据图的起始时间均为诱导时间。所有发酵实验均进行 3 次重复。表 1 本研究所用质粒Table 1 Plasmid
22、s in this study质粒 Plasmid描述 Description来源 SourcepVio在 pRSFDuet 载体的多克隆位点 2 内插入 vioABCDE 基因簇,卡那霉素抗性pRSFDuet with vioABCDE gene cluster in MCS2,KanR26pBL_401删除了 pVio 中的 vioD 基因 pVio deleted vioD本研究构建 This studypBL_403407,421423更换 pBL_401 中的 RBSb 区域 pBL_401 changed RBSb region本研究构建 This studypBL_415将 pB
23、L_401 的 Duganella sp.B2 vioA 基因从多克隆位点 2 移到多克隆位点 1,在多克隆位点前添加一个 T7 终止子Duganella sp.B2 vioA of pBL_401 was moved to MCS1 from MCS2,and a T7 terminator was added before MCS2本研究构建 This studypBL_416将 pBL_415 的 Duganella sp.B2 vioA 替换为 Janthinobacteriun violaceinigrum vioADuganella sp.B2 vioA of pBL_415 wa
24、s replaced by Janthinobacteriun violaceinigrum vioA本研究构建 This studypBL_417将 pBL_415 的 Duganella sp.B2 vioA 替换为 Pseudoduganella violaceinigra vioADuganella sp.B2 vioA of pBL_415 was replaced by Pseudoduganella violaceinigra vioA本研究构建 This studypBL_418将 pBL_415 的 Duganella sp.B2 vioA 替换为 Myxococcus xa
25、nthus vioADuganella sp.B2 vioA of pBL_415 was replaced by Myxococcus xanthus vioA本研究构建 This studypBL_419将 pBL_415 的 Duganella sp.B2 vioA 替换为 Chromobacterium violaceinum vioADuganella sp.B2 vioA of pBL_415 was replaced by Chromobacterium violaceinum vioA本研究构建 This studypBL_420将 pBL_415 的 Duganella sp
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