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基于虚拟筛选、分子对接和分子互作解析两种大球盖菇十肽的呈味特性和ACE抑制活性作用机制.pdf
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1、李文,陈万超,马海乐,等.基于虚拟筛选、分子对接和分子互作解析两种大球盖菇十肽的呈味特性和 ACE 抑制活性作用机制J.食品工业科技,2023,44(20):1117.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120208LIWen,CHENWanchao,MAHaile,etal.ExploringtheTasteCharacteristicsandACE-inhibitoryActiveMechanismofStrophariarugosoannulataDecapeptidesBasedonVirtualScreening,MolecularDocking,and
2、MolecularInteractionsJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(20):1117.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120208 未来食品 基于虚拟筛选、分子对接和分子互作解析基于虚拟筛选、分子对接和分子互作解析两种大球盖菇十肽的呈味特性和两种大球盖菇十肽的呈味特性和ACE 抑制活性作用机制抑制活性作用机制李文1,2,*,陈万超1,马海乐2,吴迪1,张忠1,杨焱1,*(1.上海市农业科学院食用菌研究所,上海201403;2.江苏大学食
3、品与生物工程学院,江苏镇江212013)摘要:为探究大球盖菇十肽的呈味特性和潜在的生物活性,以两种大球盖菇十肽(RIEDNLVIIR 和 SLPIKPRVPF)为研究对象,采用虚拟筛选、分子对接和分子互作技术,对两种大球盖菇十肽的呈味特性和 ACE 抑制活性作用机制进行预测和验证。结果显示,两种大球盖菇十肽均具有咸鲜呈味肽片段和 ACE 抑制活性肽片段。RIEDN-LVIIR 具有咸味呈味特性,SLPIKPRVPF 具有鲜味呈味特性。两种大球盖菇十肽可与 ACE 靶标蛋白受体结合形成氢键和静电相互作用。体外活性验证结果表明,大球盖菇咸味十肽 RIEDNLVIIR 的 ACE 抑制效果较好,IC
4、50值为 0.012mg/mL。分子互作热力学和动力学结果显示,RIEDNLVIIR 与 ACE 受体之间结合是焓驱动反应的特异性结合。虚拟筛选活性预测结果、体外活性验证结果、及分子对接和分子互作的 ACE 抑制机制解析结果具有一致性。研究为理解大球盖菇十肽呈味特性和 ACE 抑制活性作用机制提供理论依据,为具有 ACE 抑制活性的大球盖菇咸鲜味十肽在健康调味品和功能产品中的应用奠定基础。关键词:大球盖菇十肽,分子对接,分子热力学,分子动力学,ACE 抑制机制本文网刊:中图分类号:TS201.4文献标识码:A文章编号:10020306(2023)20001107DOI:10.13386/j.i
5、ssn1002-0306.2022120208ExploringtheTasteCharacteristicsandACE-inhibitoryActiveMechanismofStrophariarugosoannulataDecapeptidesBasedonVirtualScreening,MolecularDocking,andMolecularInteractionsLIWen1,2,*,CHENWanchao1,MAHaile2,WUDi1,ZHANGZhong1,YANGYan1,*(1.InstituteofEdibleFungi,ShanghaiAcademyofAgricu
6、lturalSciences,Shanghai201403,China;2.SchoolofFood&BiologicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)Abstract:ToexplorethetastecharacteristicsandpotentialbiologicalactivitiesofthedecapeptidesofStropharia rugos-oannulata,twodecapeptides(RIEDNLVIIRandSLPIKPRVPF)wereselectedtopredictandvali
7、datethetaste-presentingpropertiesandACEinhibitoryactivitymechanismbyusingvirtualscreening,moleculardocking,andmolecularinter-actionstechniques.TheresultsshowedthatthetwodecapeptidesofS.rugosoannulataallhadsaltyandumamitastesandACE-inhibitedpeptidefragments.RIEDNLVIRhadasaltytaste,andSLPIKPRVPFhadanu
8、mamitaste.Twodecapeptides收稿日期:20221226基金项目:上海市科技兴农项目(2020-02-08-00-12-F01484)。作者简介/通信作者*:李文(1982),女,硕士,副研究员,研究方向:食用菌蛋白质(肽)的功能性质及其构效关系,新蛋白质资源开发,食品加工副产物高值化应用,E-mail:。*通信作者:杨焱(1970),女,博士,研究员,研究方向:食用菌优良菌种选育、功能性成分分离鉴定及高效制备技术开发、活性物质和风味物质产生关键因素及作用机制解析,E-mail:。第44卷第20期食品工业科技Vol.44No.202023年10月ScienceandTech
9、nologyofFoodIndustryOct.2023ofS.rugosoannulatacouldstronglybindtoACEreceptorstoformhydrogenbondsandelectrostaticinteractions.TheinvitroactivityvalidationresultsshowedthatthesaltydecapeptideRIEDNLVIIRinhibitedtheACEwellwithanIC50valueof 0.012 mg/mL.The molecular interaction thermodynamics and kinetic
10、s results showed that the binding betweenRIEDNLVIRandACEreceptorwasthespecificbindingofenthalpy-drivenreaction.Theresultsofvirtualscreeningactivity prediction,in vitro activity validation,and molecular docking and molecular interactions for ACE inhibitionmechanismanalysiswereconsistent.Thestudyprovi
11、desatheoreticalbasisforunderstandingthetastecharacteristicsandACEinhibitionmechanismofS.rugosoannulatadecapeptidesandlaysafoundationforapplyingthedecapeptideswithACEinhibitoryactivityinhealthycondimentsandfunctionalproducts.Key words:Stropharia rugosoannulata decapeptides;molecular docking;molecular
12、 thermodynamics;molecular dyna-mics;ACEinhibitionmechanism大球盖菇,又名赤松茸,是以稻秸秆为主要栽培基质生长的草腐菌,在上海郊区广泛种植,为农业废弃物的循环利用提供了新途径。大球盖菇子实体滋味鲜美,富含蛋白质、肽及氨基酸等营养物质,不仅能带来愉悦的味觉感受,在保障人体健康中也发挥着重要的营养作用和生物活性。成熟的大球盖菇子实体中蛋白含量可达到 40%50%干重,游离肽含量可达到 11%14%干重1。大球盖菇是开发天然风味基料和营养健康产品的优质原料。血管紧张素转化酶(angiotensin-convertingenzy-me,ACE)在
13、诱导体内血压升高中起到关键作用,是治疗高血压、心力衰竭等疾病的理想药物靶点2。ACE 抑制肽能够抑制 ACE 的活性,从而起到降血压的作用。食源性 ACE 抑制肽具有高生物活性、低毒性,且易于在体内代谢,不会表现出抗高血压药物常见的副作用,对患高血压、心血管疾病等特殊人群有着重要的利用价值3。前期研究发现,多模式超声提取和辅助酶解制备的大球盖菇肽基料具有较好的降血压、抗氧化等生物活性,愉悦的咸鲜味呈味特性1,4-5。将味觉活性与食盐相当的咸鲜味呈味肽,以部分替代食盐的方式应用到食品领域,可降低因食盐摄入过量引发的高血压、冠心病等心血管疾病患病风险;同时,在不影响食品风味品质与保质期等前提下减少
14、食盐的添加量,将天然食源性咸鲜味肽作为食盐的替代品,达到“减盐不减咸”目的,在国家倡导的减盐策略执行上,有着重要的研究意义。目前,以大球盖菇为原料开发兼具 ACE 抑制功能活性及愉悦呈味特性的风味活性肽研究较少,肽的功能活性和呈味特性联动作用机制尚未有报道。因此,进一步挖掘大球盖菇风味活性肽,解析其活性、呈味机制,推进其在食品、药品领域的应用,仍然十分有必要。近年来,肽组学及生物信息学方法在食品科学中的重要性与日俱增6-7。国内外学者已有较多的应用肽组学分析方法解析食源性肽功能活性或呈味结构基础,利用分子对接、分子互作等技术手段探究食源性肽活性作用机制8-11或呈味感知机制12-15。本研究基
15、于前期采用肽组学等方法构建的大球盖菇十肽肽谱库(94 种,http:/139.224.23.107),以二级质谱峰面积排名前十、峰面积相当的两种大球盖菇十肽RIEDNLVIIR(质谱峰面积 2.58107)和 SLPIKP-RVPF(质谱峰面积 2.17107)为研究对象,采用虚拟筛选、分子对接和分子互作技术探究两种大球盖菇十肽的呈味特性、ACE 抑制活性作用机制,为大球盖菇风味活性肽开发利用提供理论依据。1材料和方法1.1材料与仪器DOJINDO 同仁化学 ACEKit-WST 试剂盒上海宥露生物科技有限公司;ACE 受体蛋白北京艾普希隆生物科技有限公司;GenemoreG-MM-IGT 生
16、物素化试剂盒江苏博美达生命科学有限公司;两种大球盖菇十肽委托吉尔生化(上海)有限公司对两种大球盖菇十肽 RIEDNLVIIR(RR-10)和SLPIKPRVPF(SL-10)进行合成,合成肽纯度大于98%;柠檬酸、蔗糖、异亮氨酸、氯化钠、谷氨酸钠北京索莱宝科技有限公司;其他试剂(分析纯)国药集团化学试剂有限公司。TS-5000ZInsent 电子舌味觉分析系统北京盈盛恒泰科技有限责任公司;Bio-TekEpoch2 酶标仪美国 BioTek 公司;Allegra25R 高速冷冻离心机美国 Beckman 公司;MS3002TS/02 电子天平梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;TANANO
17、ITC 等温滴定量热仪沃特世科技(上海)有限公司;ForteBioOctetRed96eBiolayerInterferometry(BLI)实时无标记分子相互作用仪美国 ForteBio 公司;GEPDMiniTrapG-25 预装脱盐柱GE 公司。1.2实验方法1.2.1大球盖菇十肽呈味特性及活性预测利用BIOPEP-UWM(https:/biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/)的 Sensorypeptideandaminoacids 模块,预测 RR-10 和 SF-10 的呈味特性及呈味肽片段5。利用 BIOPEP-UWM 的 Bioactivepeptid
18、e 模块,预测RR-10 和 SF-10 是否是潜在的 ACE 抑制剂及其潜在的活性肽片段16-17。利用 BIOPEP-UWM 的Enzyme(s)action 模块,预测 RR-10 和 SF-10 经胃肠蛋白酶消化后潜在的活性肽片段及其抑制率18。采用 admetSAR(http:/ 细胞穿透性和 AMEStoxic 急性口服毒性19。12食品工业科技2023 年10月1.2.2大球盖菇十肽呈味特性分析采用 TS-5000ZInsent 电子舌味觉分析系统对 RR-10 和 SF-10 的呈味特性及呈味强度进行分析。准确称取 0.1g 合成肽,加入 100mL 纯水溶解,逐级稀释为浓度梯
19、度1.0、0.75、0.5、0.375 和 0.25mg/mL 的肽溶液。以同浓度梯度的氯化钠(NaCl)和谷氨酸钠(MSG)做呈味对照5。1.2.3大球盖菇十肽体外 ACE 抑制活性分析准确称取 0.1g 合成肽,加入 50mL 纯水溶解,逐级稀释为浓度梯度 2.0、0.4、0.08、0.016 和 0.0032mg/mL的肽溶液。采用 DOJINDOACEKit-WST 试剂盒对肽溶液的 ACE 抑制活性进行测定,分析方法同试剂盒方法。以样品浓度和抑制率做 ACE 抑制活性曲线,计算抑制率 50%时的样品浓度(IC50)。1.2.4大球盖菇十肽 ACE 抑制机制预测从 PDB数据库中获得
20、ACE 受体蛋白(1O8A)的晶体结构作为靶标蛋白。利用分子对接技术,分析大球盖菇十肽与 ACE 受体结合程度。以肽-受体结合打分值、成键数量及氨基酸残基结合能为指标,筛选紧密结合的肽-受体复合物,解析肽-受体结合方式和结合位点,预测大球盖菇十肽的 ACE 抑制作用机制4。1.2.5大球盖菇十肽 ACE 抑制机制验证采用 ITC和 BLI 分子相互作用仪分析十肽和 ACE 受体之间的结合模式。将 PBS 缓冲液配制的 ACE 受体蛋白溶液注射到 ITC 样品池中,样品池温度 25,搅拌器转速1000r/min,开始至第一次滴定间隔时间 60s,总注射次数 20 次,单次注射缓冲液配制的肽配体溶
21、液2L,两次滴定时间间隔 150s,单次注射时间 2s。测量受体蛋白、肽分子结合过程中反应体系温度变化情况,ITCNano 分析软件计算受体配体结合亲和力(KD)、化学计量(N)、焓(H)和熵(S),对受体、配体是否有相互作用进行验证。将 PBS 缓冲液配制的 ACE 受体蛋白溶液进行蛋白生物素化。蛋白生物素化孵育 3060min 后进行脱盐处理。BLI 的 4 根 SSA 传感器固化生物素化的蛋白,4 根传感器做参比电极。设置基线平衡时间 60s,负载样本时间 800s,基线平衡时间 60s 程序固化受体蛋白。设置基线平衡时间 60s,结合时间 120s,解离时间 120s 生物分子互作循环
22、程序进行受体蛋白与肽分子结合、解离互作反应。使用BLI 分析程序获取受体与肽配体间结合常数 Kon、解离常数 Koff、亲和力 KD等动力学相关信息,确定ACE 受体与肽配体互作结合模式。1.3数据处理采用电子舌味觉分析系统软件进行肽段呈味强度数据采集及处理,试验所得数据以 3 次测定结果的平均值标准差表示。肽段抑制活性采用 Excel 软件处理和分析。采用 MOE2019 进行分子对接、结合方式和结合位点分析。采用 GraphPadPrism9 软件绘制 ITC 和 BLI 分析程序获得的热力学和动力学数据。2结果与分析2.1大球盖菇十肽呈味特性及活性预测分析结果BIOPEP-UWM 分析预
23、测的大球盖菇十肽呈味及活性片段结果显示,RR-10 具有呈咸鲜味的 ED 肽片段,SF-10 具有呈咸味提升的 RV 肽片段。RR-10和 SF-10 均是潜在的 ACE 抑制剂。RR-10 具有的ACE 抑制活性肽片段为 IE;SF-10 具有的 ACE 抑制活性肽片段为 IKP、PR、VP、KP 和 LP。由 BIOPEP-UWM 虚拟酶切位点分析结果可知,RR-10 经胃蛋白酶和胰蛋白酶连续消化后,理论水解度为 11.11%。RR-10 存在一个胃蛋白酶酶切位点 L-V。RR-10 及胃蛋白酶酶切片段 RIEDNL、VIIR 不能进一步被胰蛋白酶酶切,由此推测 RR-10 及其消化肽片段
24、通过细胞旁转运和跨胞途径被小肠上皮细胞完整吸收。SF-10 存在一个胃蛋白酶酶切位点 L-P,两个胰蛋白酶酶切位点 K-P 和 R-V。SF-10 经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化理论水解度为40%,产生的潜在抑制 ACE 活性肽片段 PR。SF-10模拟消化后产生的活性肽片段分子量低,可通过载体介导(PepT1 介导)转运到细胞内部发挥活性作用20。基于 admetSAR 预测结果可知,RR-10 和 SF-10 均无毒(NonAMEStoxic,评价数值分别为 0.6671 和0.7318),血 脑 屏 障 透 过 性(评 价 数 值 分 别 为0.8235 和 0.9928)和 Caco-2 细
25、胞穿透性(评价数值分别为 0.7015 和 0.7849)良好。2.2大球盖菇十肽呈味特性验证结果大球盖菇十肽电子舌呈味分析结果显示,RR-10 具有咸味和浓厚感呈味特性,SF-10 具有鲜味和浓厚感呈味特性。RR-10 在 1.0mg/mL 时开始呈现较优的咸味呈味强度,等同于同浓度 NaCl 呈咸强度表1大球盖菇十肽 RR-10 和 SF-10 呈味特性评价结果Table1EvaluationresultsofthetastecharacteristicsofthedecapeptidesRR-10andSF-10fromStropharia rugosoannulata浓度(mg/mL)
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