植物细胞微核检测技术.ppt

植物细胞微核检测植物细胞微核检测技术技术一、实验目的一、实验目的 1、了解细胞微核形成的机理及其形态特点；、了解细胞微核形成的机理及其形态特点；2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。、学习植物根尖细胞的微核检测技术。二、实验原理二、实验原理微核微核(micronucleus)简称简称MCN，是真核类生物细胞中的一，是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离片产生的，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1/201/5，这就是微核。，这就是微核。微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关相关，因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一，因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。微核测试已用于辐射指示染色体或纺锤体的损伤。微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。三、实验材料：三、实验材料：大蒜、大豆、蚕豆等。大蒜、大豆、蚕豆等。四、实验仪器设备：四、实验仪器设备：四、实验仪器设备：四、实验仪器设备：显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、载玻片及盖玻片。载玻片及盖玻片。五、实验步骤：五、实验步骤：1、浸种催芽：将实验用的蚕豆按所需要量放入盛有、浸种催芽：将实验用的蚕豆按所需要量放入盛有自来水的烧杯中，浸泡自来水的烧杯中，浸泡24h，此间至少换水两次。，此间至少换水两次。种子吸涨后，经种子吸涨后，经3648h，大部分初生根长至，大部分初生根长至12cm。2、处理根尖：阳性检测采用、处理根尖：阳性检测采用1.02.5MCrO3，0.51.5MNaN3，150250mMEMS，对照用自来水处，对照用自来水处理，处理时间理，处理时间24h。3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次，每次次2-3min，洗净后在水中恢复培养，洗净后在水中恢复培养24h。4、固定：用甲醛：冰醋酸（、固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定）固定液固定24h后弃去后弃去固定液，或换入固定液，或换入70酒精中保存。酒精中保存。5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗、酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加入次，吸净水，加入6M盐酸，于室温解离盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖，弃去盐酸，漂洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。次，彻底洗净盐酸。6、染色：截下、染色：截下1-2mm长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染色色10min，加盖玻片，压片观察。，加盖玻片，压片观察。固定固定是借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透是借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。易看清的结构。酸解酸解的作用是去除未固定的蛋白质的作用是去除未固定的蛋白质,同时使胞间层的同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。六、实验结果六、实验结果1 1、首先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相、首先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。2 2、微核识别标准：、微核识别标准：（1 1）在主核大小的）在主核大小的1/31/3以下，并与主核分离的小核。以下，并与主核分离的小核。（2 2）小核着色与主核相当或稍浅。）小核着色与主核相当或稍浅。（3 3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。3 3、每一处理观察、每一处理观察3 3个根尖，每个根尖计数个根尖，每个根尖计数100100个细胞，统计个细胞，统计其中含微核的细胞数，计算平均数，即为该处理的其中含微核的细胞数，计算平均数，即为该处理的MCNMCN，即微核千分率。，即微核千分率。样品实测样品实测MCNMCN平均值平均值对照组（标准水）对照组（标准水）MCNMCN平均值平均值污染指标（污染指标（PIPI）=微核微核微核微核MNNCE改良：改良：CBCB法微核法微核:微核微核（micronuclearmicronuclear）：无着丝粒断片（染色体碎片）或在）：无着丝粒断片（染色体碎片）或在分裂后期落后的整条染色体，在分裂末期不能纳入主核，当分裂后期落后的整条染色体，在分裂末期不能纳入主核，当进入下一个间期时，它们在细胞质内浓缩成小于主核进入下一个间期时，它们在细胞质内浓缩成小于主核1/31/3，着色与主核相同或略浅的小核。着色与主核相同或略浅的小核。胞浆分裂阻滞微核法胞浆分裂阻滞微核法(CB(CB法法)：培养基中加入：培养基中加入胞松素胞松素-B-B,后者后者不干扰细胞核分裂，但能不干扰细胞核分裂，但能阻滞胞浆分裂阻滞胞浆分裂。分裂一次的淋巴细。分裂一次的淋巴细胞的胞浆中出现胞的胞浆中出现双细胞核双细胞核,简称简称CBCB细胞。细胞。CBCB细胞大细胞大,具有双核具有双核,易于鉴别。双核细胞是只经历一次分裂的细胞。易于鉴别。双核细胞是只经历一次分裂的细胞。CBCB法估算剂量范围：法估算剂量范围：0.25-5.0Gy0.25-5.0Gy；受受照照后后微微核核随随时时间间变变化化规规律律:照照射射后后立立刻刻升升高高,然然后后保保持持恒定水平恒定水平,持续时间不清；持续时间不清；照后尽早采血照后尽早采血,不超过一月；不超过一月；微核法：直接涂片法、培养法、微核法：直接涂片法、培养法、CBCB法；法；微微核核仅仅出出现现在在诱诱发发后后经经过过一一次次分分裂裂的的间间期期细细胞胞传传统统微微核核法法不不能能分分辨辨未未转转化化、分分裂裂一一次次和和一一次次以以上上的的淋淋巴巴细细胞胞,影影响微核测试的准确性；响微核测试的准确性；CBCB法法计数计数CBCB细胞中的微核细胞中的微核,可显著提高微核检测的灵敏度可显著提高微核检测的灵敏度和准确性。和准确性。MNMNCBCB法法优优点点：方方法法简简单单,分分析析快快速速,易易于于掌掌握握,有有利利于于自自动动化化分分析析,尤尤其其在在核核事事故故涉涉及及的的人人员较多时更显示具优越性。员较多时更显示具优越性。缺点：不像双着丝粒体对辐射敏感、特异；缺点：不像双着丝粒体对辐射敏感、特异；自发率高，自发率高，1 12 2；个体差异大，自发；个体差异大，自发率与性别无关，与年龄呈正相关，估算剂率与性别无关，与年龄呈正相关，估算剂量下限的不确定性高；衰减速度比双着丝量下限的不确定性高；衰减速度比双着丝粒体快。粒体快。进展：进展：稳稳定定性性染染色色体体畸畸变变（易易位位）分分析析：荧荧光光原原位位杂交杂交(FISH)(FISH)技术技术 利用生物素利用生物素(biotin)(biotin)标记的标记的已知碱基序列的已知碱基序列的核酸核酸作为作为探探针针,按照碱基互补的原则按照碱基互补的原则,与与标本上标本上染色体染色体同源序列进行同源序列进行特异性结合（特异性结合（原位杂交原位杂交）,然后用荧光标记的生物素亲然后用荧光标记的生物素亲和蛋白和蛋白 (avidin)(avidin)和抗亲和蛋白的抗体进行免疫监测和和抗亲和蛋白的抗体进行免疫监测和放大放大,使探针杂交区发出使探针杂交区发出荧光荧光(显色显色),形成可监测的杂交形成可监测的杂交双链核酸双链核酸,最后在荧光显微镜下检查探针存在与否。结最后在荧光显微镜下检查探针存在与否。结合了探针的染色体呈现出特定的颜色合了探针的染色体呈现出特定的颜色,未结合探针的染未结合探针的染色体不着色色体不着色,如着色与未着色的染色体间发生了互换如着色与未着色的染色体间发生了互换,这这种异常的染色体在荧光显微镜下非常容易鉴别。种异常的染色体在荧光显微镜下非常容易鉴别。1 14 4FISHFISHFISHFISH易位易位易位易位特点：特点：L L FISHFISH与与G G显显带带相相比比，节节省省了了人人力力物物力力,由由于于不不需需要要分分散散良良好好的的分分裂裂相相,增增加加了了分分析析的的细细胞胞数数,提提高高了了检检测的精确度。测的精确度。L L FISHFISH对对结结构构畸畸变变分分析析较较常常规规法法快快速速、准准确确,有有望望成成为为较较理理想想的的生生物物剂剂量量计计。是是当当前前辐辐射射细细胞胞遗遗传传学学发展中的一门前沿技术。发展中的一门前沿技术。缺点：缺点：l l对对倒倒位位和和缺缺失失等等不不大大敏敏感感；探探针针的的特特异异性性；价价格格昂贵。昂贵。七、思考题七、思考题1 1、在植物细胞的微核检测实验中，为什么要、在植物细胞的微核检测实验中，为什么要进行进行24h24h的恢复培养？的恢复培养？2 2、产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期、产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图像？可能出现什么样的中期分裂图像？绘蚕豆根尖细胞微核图。绘蚕豆根尖细胞微核图。