基因组dna的提取课件.ppt
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1、基因组基因组dnadna的提取课的提取课件件 2 核酸是遗传信息的载核酸是遗传信息的载体,是最重要的生物信息体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究分子,是分子生物学研究的主要对象。核酸样品的的主要对象。核酸样品的质量直接关系到实验的成质量直接关系到实验的成败。败。【原理原理】3DNADNA提取原则提取原则1 1:DNADNA片段长度(完整性)片段长度(完整性)DNADNA提取原则提取原则2 2:排除其它分子污染(纯度):排除其它分子污染(纯度)4破碎细胞破碎细胞 提提 取取 纯纯 化化 5破碎细胞破碎细胞 提提 取取 纯纯 化化机机 械械 法法化化 学学 法法酶酶 法法 6破碎细胞破碎细
2、胞 提提 取取 纯纯 化化沉淀法:沉淀法:异丙醇、无水乙醇异丙醇、无水乙醇介质吸附:介质吸附:硅基质硅基质:高盐低高盐低pH值值 结合核酸结合核酸 低盐高低盐高pH值值 洗脱洗脱 阴离子交换树脂阴离子交换树脂 磁珠磁珠 7破碎细胞破碎细胞 提提 取取 纯纯 化化沉淀法:沉淀法:晾干异丙醇或乙醇;适晾干异丙醇或乙醇;适 量量buffer溶解溶解介质吸附:介质吸附:硅基质硅基质:洗杂,空甩洗杂,空甩 2 min,晾晾干;干;低盐高低盐高pH值值 洗脱洗脱 8 9【试剂与器材试剂与器材】1.1.小白鼠(小白鼠(3 3人一组,每人一组,每2 2组一只)组一只)2.2.微量加样器微量加样器 3.3.匀浆
3、器匀浆器4.4.动物组织基因组动物组织基因组DNADNA 提取试剂盒提取试剂盒5.5.生理盐水生理盐水 10小白鼠小白鼠肝肝脱颈处死脱颈处死脱颈处死脱颈处死 右手抓住鼠尾用力向后拉右手抓住鼠尾用力向后拉,同时左手拇指与食指用力向下同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断,按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断,鼠便立即死亡。鼠便立即死亡。【操作流程操作流程】11匀浆器匀浆匀浆器匀浆采用相应的蛋白变性剂和采用相应的蛋白变性剂和蛋白酶蛋白酶K进行处理,消化进行处理,消化蛋白蛋白【操作流程操作流程】沉淀核酸沉淀核酸消化去蛋白消化去蛋白 12 【操作流程操作流程I I】肝+2 mL 2 mL 生理盐水
4、700700L匀浆液离心12000 rpm,12000 rpm,1 min,1 min,弃尽上清破碎细胞破碎细胞加加 GAGA 200 200 L L振荡至彻底悬浮加加 蛋白酶蛋白酶K K 20 20 L L56,60 min,56,60 min,裂解组织,消化蛋白短暂离心(5秒)加加 GBGB 200 200 L L充分混匀,70,10 min70,10 min短暂离心(5秒)标记!标记!上交上交,-20保存硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法消化蛋白消化蛋白 13 14 【操作流程操作流程IIII】加加 乙醇乙醇 200 200 L L 混匀至少混匀至少15s15s 短暂离心短暂离心硅胶膜吸附法硅胶膜
5、吸附法沉淀核酸沉淀核酸裂解的样本裂解的样本加入吸附柱加入吸附柱缓冲液冲洗缓冲液冲洗DNA洗脱收集洗脱收集注意:动作要轻柔注意:动作要轻柔 15 【操作流程操作流程IIII】硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法沉淀核酸沉淀核酸裂解的样本裂解的样本加入吸附柱加入吸附柱缓冲液冲洗缓冲液冲洗DNA洗脱收集洗脱收集核酸吸附核酸吸附将上一步所得溶液和絮状沉淀都将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱加入一个吸附柱CB3CB3中;中;吸附柱放入收集管中吸附柱放入收集管中 ;12,000rpm12,000rpm离心离心30s30s;倒掉废液,将吸附柱倒掉废液,将吸附柱CB3CB3放回收集放回收集管中管中 注意:未完全消
6、化注意:未完全消化的组织块不要加入的组织块不要加入吸附柱中!吸附柱中!16 【操作流程操作流程IIII】硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法沉淀核酸沉淀核酸裂解的样本裂解的样本加入吸附柱加入吸附柱缓冲液冲洗缓冲液冲洗DNA洗脱收集洗脱收集核酸吸附核酸吸附漂洗去杂漂洗去杂漂洗液漂洗去蛋白片段,盐分和漂洗液漂洗去蛋白片段,盐分和其它杂质其它杂质向吸附柱中加入向吸附柱中加入500500L L GDGD,12,000rpm12,000rpm离心离心30s30s,弃废液,将吸,弃废液,将吸附柱放回收集管中;附柱放回收集管中;向吸附柱中加入向吸附柱中加入700 700 L LPWPW,12,000rpm12,000r
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