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基于网络药理学与实验验证探讨升降散调控脓毒症免疫功能紊乱的作用机制.pdf
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1、网络出版时间:网络出版地址:网络药理学基于网络药理学与实验验证探讨升降散调控脓毒症免疫功能紊乱的作用机制颜诗帆,余婷,刘文,顾潇霄,蒋宇,陈芳,刘艳娟,祝益民,湖南中医药大学中西医结合学院,湖南 长沙 ;湖南省人民医院(湖南师范大学第一附属医院)急救医学研究所 急危重症代谢组学湖南省重点实验室,湖南 长沙 ;江西中医药大学研究生院,江西 南昌 收稿日期:,修回日期:基金项目:国家自然科学基金资助项目();湖南省自然科学基金项目(,);湖南省卫健委();湖南省教育厅();湖南中医药大学研究生创新课题()作者简介:颜诗帆(),男,博士生,研究方向:中西医结合临床,:;祝益民(),男,博士,教授,博
2、士生导师,研究方向:中西医结合危重症,通信作者,:;刘艳娟(),女,博士,助理研究员,研究方向:脓毒症免疫调节,通信作者,:文献标志码:文章编号:()中国图书分类号:;摘要:目的验证升降散在脓毒症中的作用并探讨其分子机制。方法通过 、等数据库搜索药物活性成分作用靶点与疾病相关靶点,并将二者取交集。采用 数据库对交集靶点进行 、通路富集分析,将药物活性成分与关键通路的核心基因进行分子对接。采用盲肠结扎穿刺(,)构建脓毒症小鼠模型,收集小鼠脾脏组织与血清,采用流式细胞术检测脾脏中不同 细胞亚群百分比,采用 检测血清中 、水平。结果网络药理学分析搜索获得升降散活性成分 个,活性成分作用靶点 个,疾病
3、相关靶点 个,活性成分与疾病相关靶点交集基因有 个,潜在靶标为 、等;功能富集分析,得到条目数 条,其中生物过程 条,细胞组成 条,分子功能 条。通路分析发现交集基因主要富集在 信号通路、信号通路、信号通路、炎症介质信号通路等,表明其治疗效果可能和这些通路有关。分子对接结果显示,槲皮素、山奈酚、大黄素等核心化合物与关键基因都能较好的结合。流式细胞术结果显示,后小鼠脾脏 细胞比例减少,细胞比例增加,释放减少,含量增加,小鼠呈免疫抑制状态。给予升降散灌胃治疗后小鼠脾脏 细胞百分比增加,细胞数量减少,释放增强,含量降低,小鼠免疫抑制得以改善。结论升降散能增加脓毒症晚期促炎症细胞因子 释放,提高 细胞
4、比值,降低抗炎性细胞因子 表达,以改善脓毒症晚期免疫抑制,提高小鼠生存率。关键词:网络药理学;脓毒症;升降散;分子对接;免疫抑制;炎症因子开放科学(资源服务)标识码():脓毒症是感染引起的危及生命的器官功能障碍综合征 ,常并发于严重创伤、烧伤、休克和外科大手术后,由其诱导的多器官功能障碍综合征已成为重症监护病房的主要死亡原因 。传统理论认为,脓毒症早期免疫系统过度激活所导致的细胞因子风暴是患者死亡的重要机制之一。但是迄今为止,三十几个细胞因子的抗体和抗炎药物的临床试验显示它们对脓毒症并没有疗效 。越来越多的证据显示,在脓毒症的发生发展中,机体从早期的高炎症反应阶段逐渐进展到后期的抗炎和免疫抑制
5、阶段,从而导致感染的无法控制以及机会性细菌的再次感染 。因此,寻找能有效改善脓毒症晚期免疫抑制的药物将成为提高脓毒症患者生存率的关键 。升降散由僵蚕(君药)、蝉蜕(臣药)、姜黄(佐药)、大黄(使药)组成,具有宣郁散热、降浊逐秽等传统中医功效。安鹏等 发现脓毒症早期患者使用升降散具有调控 、细胞,平衡 作用;奚耀等 也证实升降散在脓毒症中具有调节免疫细胞 ,减少 、等炎症因子的效果。然而,其作用机制目前尚不完全清楚。本研究拟基于网路药理学与实验验证探讨升降散治疗脓毒症的相关作用机制。材料与方法 材料 动物 只 周,雄性小鼠中国药理学通报 ;():()购自于长沙斯莱克景达实验动物有限公司,动物生产
6、许可证号为 (湘),饲养于湖南省人民医院中心实验室 级动物房,实验前适应性喂药 周。所有动物均按照湖南省人民医院动物伦理委员会批准的动物饲养和指南进行,伦理批号为伦审科 第()号。试剂 、流式 抗 体 购 自 公 司(货 号 、);、试剂盒购自 公 司(货 号 、)。方法 升降散治疗脓毒症网络药理学分析 升降散活性成分筛选与活性成分作用靶点收集 采用 数据库()以口服生物利用度(,)和类药性(,)为条件,搜索姜黄与大黄有效成分;以类药五原则为条件筛选僵蚕与蝉蜕有效成分。进一步用 和 (:)数据库搜索上述活性成分的作用靶点。疾病相关靶点的获取利用 (:)、(:)、(:)、(:)数据库,以“”为关
7、键词,得到脓毒症相关靶点。构建药物 活性成分 靶点网络图及可视化分析采用 (:)将药物活性成分作用靶点与疾病相关靶点取交集,绘制韦恩图。将交集基因、药物、化合物导入 软件构建“药物 活性成分 靶点”网络图,根据 值筛选关键活性成分。构建蛋白互作()网络及分析通过 软件构建上述交集基因的 网络图,采用 插件对网络图中拓扑参数 ()、()、()进行分析,并筛选出核心基因。、通路富集分析运用 数据库(:)对上述交集基因进行 、通路富集分析(),并对生成的结果进行可视化处理。活性成分与分子靶点对接将药物活性成分与核心基因进行分子对接,在 数据库(:)寻找核心基因 文件,在 数据库寻找活性成分 文件,运
8、用 软件进行分子对接。升降散的制备升降散在临床治疗时白僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄四类药物按 配比使用;因此我们从江西中医药大学附属医院购置白僵蚕 (批号 ),全蝉蜕 (批号 ),姜黄 (批号 ),川大黄 (批号 ),将购买的药物置砂锅中,加 倍体积纯净水浸泡 ,煎煮 。水煎液经 层纱布过滤,滤渣用 倍体积纯净水再次煎煮 。水煎液再次经 层纱布过滤,合并两次滤液,水浴减压浓缩。浓缩液于 超低温冰箱中冷冻过夜,置预冷的真空冷冻干燥机中干燥 ,得干燥粉末 ,得率 。盲肠结扎穿孔制备脓毒症模型 将雄性 小鼠手术前 禁食,手术过程以异氟烷吸入麻醉,沿腹部正中线作长约 切口,游离肠系膜和盲肠,号丝线在盲肠盲端
9、 处结扎,针头于盲肠末端对合穿孔,挤出少许肠内容物,将盲肠放回腹腔内,逐层关腹。术后皮下注射 生理盐水补充体液,假手术组小鼠不做穿孔处理,其他操作相同。不同浓度脓毒症升降散动物实验分组将 只雄性 小鼠随机分成 组,分别为假手术组()、组()、低剂量升降散组()、中剂量升降散组()、高剂量升降散组(),根据人体与小鼠药物等效剂量换算,低剂量为 、中剂量为 、高剂量为 ,给予脓毒症小鼠灌胃(次),假手术组与脓毒症组给予等量的生理盐水,第 次给药时间为术后 ,此后连续给予 ,日 次,观察脓毒症小鼠 生存率,为后续实验提供支持。检测小鼠血清 、含量收集第 天小鼠血液,离心得到小鼠血清,按照 公司 试剂
10、盒说明书进行操作。首先,将 与 抗体预包被在 孔微孔板中(过夜)。其次,加入 脓毒症小鼠血清,孵育 ,洗板,再加入抗 抗体与抗 抗体,室温孵育 ,洗板。最后,向孔板中加入终止液。处测量吸光度。流式细胞术检测不同亚群 细胞的百分比收集第 天小鼠脾脏组织,运用研磨滤网制成单细胞悬液,采用红细胞裂解液裂解红细胞,清洗中国药理学通报 ;()细胞 次,再用 重悬至最终细胞浓度为 。每个样本管中加入待测指标流式抗体,避光孵育 ,清洗 次,内上机检测。统计学分析采用 进行统计学分析,计量资料用珋 表示,多组之间比较采 用 单 因 素 方 差 分 析,两 两 比 较 采 用 ()法。结果 升降散活性成分采用
11、数据库对升降散活性成分进行筛选,共得到僵蚕活性成分 个,蝉蜕活性成分 个,姜黄活性成分 个,大黄活性成分 个(、)。交集基因“药物 活性成分 靶点”与 网络图采用 与 数据库搜索药物活性成分作用靶点,共获得靶点 个。进一步采用 、与 数据库检索脓毒症相关靶点,搜索获得疾病相关靶点 个。将药物活性成分作用靶点与疾病相关靶点取交集,绘制韦恩图,获得交集基因 个,见 。将上述交集基因、药物活性化合物与药物导入 软件构建“药物 化合物 靶点”网络图,发现该网络图共有 个节点,条边,见 ,并根据 值筛选槲皮素()、去甲氧基姜黄素()、大黄素()、山奈酚()等关键化合物。绘制交集基因 网络图,发现 、等为
12、升降散治疗脓毒症核心基因,见 。(),()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()()中国药理学通报 ;()“”:;:“”(,);:富集分析将 个潜在靶点,通过 数据库,进行 功能富集分析(),见 ,得到条目数 条,其中生物过程(,)条,细胞组成(,)条,分子功能(,)条。分析发现 主要有磷酸酶结合、蛋白激酶调节活性等;主要包括活性氧代谢过程的调节、聚合酶 转录因子复合物等;主要包括细胞对氧化应激的反应、炎症反应的调节、细胞对外界刺
13、激的反应等,见 。通路分析将 个交集基因进行 通路分析,共获得 条通路(),选取排名前 条通路绘制气泡图(),信号通路、信号通路、炎症介质信号通路等免疫稳态相关信号通路。活性成分 关键靶点分子对接分数热力图选择“药物 活性成分 关键靶点”网络图中 排名前 的活性成分与核心靶点进行分子对接,核心靶点蛋白通过 数据库获得,对接结果显示活性化合物与关键靶点具有很好的结合能力,见 。不同浓度升降散治疗脓毒症小鼠生存率曲线与 组相比,给予不同剂量升降散治疗的脓毒症小鼠生存率明显升高,这表明升降散具有治疗脓毒症小鼠的作用。研究还发现中剂量升降散保护作用最佳,后期的实验,我们将采用中等剂量的升降散来探究其保
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