基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨止咳化痰作用机制.pdf
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1、罗慧英,吴步梅,马天玥,等.基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨止咳化痰作用机制 J.食品工业科技,2023,44(23):1120.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010103LUOHuiying,WUBumei,MATianyue,etal.BasedonNetworkPharmacologyandMolecularDockingtoDiscusstheMechanismofAntitussiveandExpectorantActionofRuanerliJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(23):1
2、120.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010103 未来食品 基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨基于网络药理学与分子对接探讨兰州软儿梨止咳化痰作用机制止咳化痰作用机制罗慧英1,2,吴步梅3,马天玥4,张文利3,方彩霞3,魏永波5,陈辅斌6(1.甘肃中医药大学药学院,甘肃兰州730000;2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室,甘肃兰州730000;3.兰州市农业科技研究推广中心,甘肃兰州730000;4.中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京211198;5.皋兰百璐通瓜果专业合作社,甘肃兰州
3、730200;6.什川镇农业农村综合服务中心,甘肃兰州730200)摘要:采用网络药理学方法预测软儿梨止咳化痰作用及其机制,并采用分子对接和动物实验对预测结果予以验证。通过文献调研和 TCMSP 等数据库筛选得到软儿梨的成分与作用靶点,与 GeneCards 数据库中“咳嗽(cough)”和“痰(sputum)”相关的两组基因相映射,得到软儿梨止咳化痰作用的靶点基因。通过 Metascape 平台对靶点基因进行 GO 和 KEGG 富集分析;通过 STRING 数据平台构建靶点基因间 PPI 网络;利用 Cytoscape 插件 CytoHubba 筛选软儿梨止咳化痰作用 Top10 基因,并
4、通过 Metascape 数据平台对 Top10 基因进行 KEGG 通路富集以预测软儿梨止咳化痰作用可能涉及的信号通路。通过 AutodockVina 对预测所得 Top10 基因蛋白和软儿梨Top3 活性成分进行分子对接;最后通过氨水引咳试验和酚红排泄试验对预测所得结果进行验证。经多数据库联合分析,发现软儿梨中已见报道的化学成分有 51 个,对应作用靶点 282 个,其中 80 个与止咳化痰作用有关,根据Degree 值筛选出的 Top10 基因主要富集在与感染和免疫相关通路上。分子对接试验证明 Top10 基因与 PPI 网络中排名前 3 位的化学成分(咖啡酸、芦丁、戊醛)有较强的结合活
5、性。动物实验证明软儿梨可以明显抑制小鼠氨水引发的咳嗽反应,降低血清中 IL-6 和 IL-13 水平,增加小鼠气管酚红的排泄量。PCR 和 WB 检测发现,软儿梨可降低炎症相关基因 IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 的 mRNA 水平和蛋白表达,软儿梨的止咳化痰作用可能与降低炎性基因表达,减少致炎因子释放有关。关键词:网络药理学,分子对接,软儿梨,止咳化痰,炎症因子本文网刊:中图分类号:R151.2文献标识码:A文章编号:10020306(2023)23001110DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023010103BasedonNetworkPh
6、armacologyandMolecularDockingtoDiscusstheMechanismofAntitussiveandExpectorantActionofRuanerliLUOHuiying1,2,WUBumei3,MATianyue4,ZHANGWenli3,FANGCaixia3,WEIYongbo5,CHENFubin6(1.CollegeofPharmacy,GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China;2.KeyLaboratoryofPharmacologyandToxicologyforTradition
7、alChineseMedicineofGansuProvince,Lanzhou730000,China;3.LanzhouAgrotechnicalResearchandPopularizationCenter,Lanzhou730000,China;4.SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing211198,China;5.BailutongMelonandFruitFarmerCooperatives,Lanzhou730200,China;收稿日期:20230116基金项目:甘肃省农业农村
8、厅资助项目(20221809RB)。作者简介:罗慧英(1979),女,博士,教授,研究方向:中药药效与物质基础研究,E-mail:。第44卷第23期食品工业科技Vol.44No.232023年12月ScienceandTechnologyofFoodIndustryDec.20236.ShichuanAgricultureandRuralComprehensiveServiceCenter,Lanzhou730200,China)Abstract:TheantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerlianditsmechanismwereinvestigat
9、edbymethodsofnetworkpharmacology.Theoutcomespredictedwereverifiedbymoleculardockingandanimalexperiments.ThecomponentsandtargetsofRuanerliwereobtainedbyliteratureinvestigationandTCMSPdatabasescreen.MappingwithtwogroupsofgenesrelatedtocoughandsputumfromGeneCardsdatabase,thetargetgenesofantitussiveande
10、xpectoranteffectsofRuanerliwereobtained.GOandKEGGenrichmentanalysisofthetargetgeneswasperformedbyMetascapeplatform.ThePPInetworkamongthetargetgeneswasconstructedthroughSTRINGdataplatform.CytoscapepluginCytoHubbawasusedtoscreentheTop10genesrelatedtoantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerli,andKEGGpa
11、thwayenrichmentwasperformedontheTop10genesthroughMetascapedataplatformtopredictthepossiblesignalpathwaysinvolvedinantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerli.AutodockVinawasusedformoleculardockingbetweenthepredictedTop10geneproteinsandtheTop3activeingredientsofRuanerli.Finally,thepredictedresultswere
12、verifiedbyammoniainducedcoughtestandphenolredexcretiontest.Accordingtotheanalysisofmultipledatabases,51chemicalcomponentsand282correspondingtargetshavebeenreported,eightyofthemwererelatedtotheantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerli.TheTop10genesselectedbyDegreevalueweremainlyconcentratedininfecti
13、onandimmune-relatedpathways.MoleculardockingtestshowedthattheTop10geneshadstrongbindingactivitywiththeTop3chemicalcomponents(Caffeicacid,RutinandValeraldehyde)inPPInetwork.AnimalexperimentsshowedthatthecoughinducedbyammoniawassignificantlyinhibitedwhentreatedwithRuanerliinmice.ThelevelsofIL-6andIL-1
14、3inserumwerereducedandtheexcretionofphenolredinmicetracheawasincreased.PCRandWBdetectionshowedthatthemRNAlevelsandproteinexpressionsofinflammatorygenesIL6,IL1B,VEGFA,PTGS2andMAPK3weredecreased,suggestingthattheantitussiveandexpectoranteffectsofRuanerlimightberelatedtodecreasingtheexpressionofinflamm
15、atorygenesandthereleaseofinflammatoryfactors.Keywords:networkpharmacology;moleculardocking;Ruanerli;antitussiveandexpectoranteffects;inflammatoryfactor软儿梨(Pyrus ussuriensisMaxim.)也叫冻梨、香水梨,是兰州特色水果。食用方法独特,具有后熟发酵及冻食特性。每年深秋采摘,新鲜果品口味欠佳,果肉硬而味酸,冷冻贮藏 40 多天后,果皮变黑,果肉发酵软化,其品质不因褐变而受到影响,果糖含量增加,此时食用梨软如泥,浆液充盈,味甜似蜜
16、,是中国地方梨品种中的一个特色品种。2015 年被农业部批准为“全国农产品地理标志”。兰州年产软儿梨 3 万多吨,但是由于技术原因,除直接食用和简单加工后制成果汁、果酒外,未见高附加值的下游产品,资源浪费巨大,高值化、多品类的开发利用成为现今迫切需求。咳嗽是呼吸道系统的常见病。中医认为“肺主宣发和肃降”,肺气宣发通畅,则能主一身之气而呼吸调匀,助血液循环而贯通百脉12。但肺为娇脏,最易受外邪侵袭,如果受到风、寒、暑、湿、燥、火六淫的侵袭,就会造成肺失宣降,肺气上逆,引起咳嗽。按病邪性质咳嗽可分为风寒咳嗽、风热咳嗽、风燥咳嗽,痰湿咳嗽等36。秋冬时节,由于气候干燥多燥邪或风邪犯肺引发咳嗽,治疗多
17、以清热去燥;而内伤咳嗽,多以脏器功能的失调为基础,以痰湿、痰热、肝火犯肺,肺阴亏损等为主要病症,治疗多以滋阴润肺为主79。软儿梨性凉味甘,富含果酸、苹果酸、柠檬酸、蔗糖、葡萄糖等成分,具有清热解毒、润燥止咳,生津化痰、滋身祛疾之功效1011,是药食兼备的妙品。本草纲目记载软儿梨有润肺、止咳、凉心消炎、降火、解疮毒、解酒等多种功效,当地人常服食之以镇咳化痰,但其具体作用机制鲜见报道。本研究旨在采用网络药理学方法和生物信息分析技术对软儿梨止咳化痰作用进行研究,并通过分子对接和动物实验对分析结果进行验证,以期为软儿梨止咳化痰功效提供理论与试验依据。1材料与方法1.1数据库与软件中药系统药理学数据库(
18、TCMSP,http:/ 数据库(https:/cn.string-db.org/)、GeneCards 数据库(https:/www.genecards.org/)、Metascape 分析平台(https:/metascape.org/)、PubChem 数据库(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Uiprot 数据库(https:/www.uniprot.org/)、PDB 数据库(https:/www.rcsb.org/)、Cytoscape3.6.1、AutodockVina2.1、Chem3D、Pymol3.3、Venny2.1.0 等。1.2材料与
19、仪器软儿梨冻梨甘肃皋兰百璐通瓜果专业合作社提供,剥去表皮后自然解冻取汁 1000mL,相当于软儿梨冻梨 1460.7g,经高效液相色谱法测定,总酚含量为 149.14mg/kg、总黄酮含量为 58.23mg/kg12;SPF 级昆明小鼠100 只,1820g,雌雄各半,甘肃中医药大学实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(甘)2015-0002,动物伦理审查批号:20220714;麻杏止咳糖浆太极集团四川南充制药有限公司,国药准字 Z51022042;氨水、酚红青岛海湾精细化工有限公司;IL-6ELISA 试剂盒、IL-13ELISA 试剂盒南12食品工业科技2023 年12月京建成生物工程
20、研究所;RT-PCR 试剂盒、逆转录试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒、RNA 提取(Trizol 法)试剂盒上海翌圣生物科技股份有限公司;兔抗 IL6多克隆抗体、兔抗 IL1B 多克隆抗体、兔抗 MAPK3多克隆抗体、兔抗 VEGFA 多克隆抗体、兔抗PTGS2 多克隆抗体上海酶联生物科技有限公司。UV-5500 型紫外分光光度计、BS124S 型电子天平、B-600 型超微量分光光度计上海元析仪器有限公司;TDL-5M 型台式大容量低温离心机上海精密仪器仪表有限公司;医用 KJR-602C 型超声雾化器合肥康居人智能科技有限公司;SUNRISE 酶联免疫检测仪瑞士 TECAN 公司;PCR 扩增仪
21、、实时荧光定量 PCR 仪美国 AppliedBiosystem 公司;1645050 型基础电泳仪、Mini-PROTEANTetra 电泳槽、小型 rans-Blot 转印槽美国 Bio-Rad 公司。1.3实验方法1.3.1软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析通过调研,收集文献已报道的软儿梨化学成分,TCMSP、本草组鉴、ECTM 数据库中检索其对应的作用靶点。GeneCards 数据库中分别以关键词“咳嗽(cough)”和“痰(sputum)”检索,得到与咳嗽和生痰相关的两组基因。将 GeneCards 数据库中所得两组基因与软儿梨的作用基因相映射,得到软儿梨止咳化痰作用的靶点基因。Ven
22、ny2.1.0 绘制维恩图,Cytoscape 绘制软儿梨止咳化痰作用成分-靶点图。将软儿梨止咳化痰作用靶点基因提交至 Metascape 数据分析平台,进行GO 功能富集分析(包括Biologicalprocess、Cellularcomponent、Molecularfunction)和 KEGG 通路富集分析。将软儿梨止咳化痰作用靶点基因提交至STRING 数据平台,构建软儿梨止咳化痰作用靶点基因间的蛋白互作网络(PPI 网络)。利用 Cytoscape插件 CytoHubba,根据 Degree 值过滤出 PPI 网络中的关键基因(Top10 基因)。通过 Metascape 数据平台
23、对 Top10 基因进行 KEGG 通路富集,预测软儿梨止咳化痰作用可能涉及的信号通路。1.3.2软儿梨止咳化痰作用 Top10 基因分子对接验证Uiprot 数据库、PDB 数据库中检索下载 Top10基因的蛋白结构,PubChem 数据库中下载 PPI 网络中排名前 3 位的化学成分 3D 结构。采用 Chem3D、Pymol 对受体和配体进行加氢、去水、均电荷等预处理,采用 AutodockVina 进行对接,设置对接 20 次,采用 Pymol 将结合能最小的对接结果可视化。1.3.3软儿梨止咳化痰作用动物试验验证1.3.3.1氨水引咳试验SPF 级昆明种小鼠 50 只,雌雄各半,体重
24、 1820g,随机分为 5 组,分别为软儿梨高、中、低剂量组(软儿梨原汁 0.2、0.15、0.1mL/10g),麻杏止咳糖浆(0.1mL/10g)为阳性对照组,生理盐水(0.1mL/10g)为空白对照组;每天灌胃给药1 次,连续 10d。于最后 1 次给药 1h 后逐一将小鼠放入钟罩内,用医用超声雾化器以最大喷雾量(0.2mL/min)向钟罩内喷入 25%氨水气雾对小鼠进行引咳,15s 后将小鼠移出,记录从开始喷雾到小鼠产生第一次咳嗽所需时间(咳嗽潜伏期)和 3min 内咳嗽次数13。小鼠典型咳嗽症状为:腹部内缩,同时张大口,有咳嗽声。并按公式计算止咳率。止咳率(%)=给药组咳嗽潜伏期空白组
25、咳嗽潜伏期1001.3.3.2酚红排泄试验SPF 级昆明种小鼠 50 只,雌雄各半,分组及给药方法同氨水引咳试验。末次给药 30min 后小鼠腹腔注射 5%的酚红溶液 0.5mL(0.5g/kg),30min 后处死动物,剥离甲状软骨下至气管分叉处的气管,放入盛有 2mL 生理盐水的试管中,加入1mol/L 的NaOH0.1mL 摇匀,于波长546nm处测吸光度,根据标准曲线,计算酚红含量(g/mL)14。1.3.3.3ELISA 法检测血清炎症因子水平氨水引咳试验中的小鼠,记录咳嗽潜伏期和 3min 内咳嗽次数后,摘眼球取血,离心取血清,按 ELISA 试剂盒说明测定血清中 IL-6 和 I
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