基于气相色谱-质谱技术颌面部间隙感染细菌类型快速诊断方法的建立.pdf

:/军事口腔医学专题基于气相色谱 质谱技术颌面部间隙感染细菌类型快速诊断方法的建立任 睿 孔 亮 吴巍炜 张广健 姜 雪 宁芮之 张言鹏 赵瑞华 李云鹏(延安大学生命科学学院微生物教研室 陕西 延安 口颌系统重建与再生全国重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 陕西省口腔疾病临床医学研究中心 空军军医大学口腔医院颌面外科 陕西 西安 西安电子科技大学:先进材料与纳米科技学院前沿交叉研究院 陕西 西安 西安交通大学第一附属医院胸外科 陕西 西安)基金项目:陕西省重点研发计划 重点产业创新链(群)项目()空军军医大学军事医学人才助推“砺剑行动”孵化军事医学人才项目()作者简介:任 睿 硕士研究生 从事颌面间隙感染常见细菌快速鉴定研究:通信作者:李云鹏:网络首发:/()摘要 目的 探索基于气相色谱 质谱()技术的颌面部间隙感染()细菌类型的快速诊断方法 方法 选择 常见细菌金黄色葡萄球菌()作为研究对象 体外培养扩增 离心计数 通过 技术检测该菌产生的挥发性有机化合物()与空白培养基的背景化合物对比后获得 特异性靶标化合物()临床随机选取 例间隙感染患者的脓液 梯度离心后计数并获得菌体沉淀 检测后获得临床样本特异性靶标化合物()通过比较两者相同化合物的峰面积 计算后得到临床感染 的概率 结果 临床样本获得后检测时长约 标准品共检测出 种 按照峰浓度和变量投影重要性选取前 种 作为该菌的特异性靶标化合物 与该 种 通过计算得出 例患者感染 的概率分别为、临床实际菌培养结果为:未检出、乳酸乳球菌、毗邻乏养菌 结论基于 技术可以大幅缩短细菌类型的诊断时间 基于 技术的细菌类型诊断结果与临床细菌培养结果一致性较好 该技术亦可为战时颌面部感染类疾病的细菌类型快速诊断提供理论及实践依据关键词 颌面部间隙感染 气相色谱质谱 金黄色葡萄球菌 挥发性有机化合物 细菌标记中图分类号 文献标志码 ()()()()()():/:颌 面 部 间 隙 感 染()是发生于颜面、颌周、口咽部潜在筋膜的化脓性炎症 也是口腔颌面外科最常见的急重症疾病类型 通常牙源性感染为主要病因 即由于龋齿、牙周炎、智齿冠周炎等未经及时正规治疗 逐渐发展至周围组织引起 而战争时期 创伤后感染为其主要病因 即由于战场环境恶劣 伤口及其周围皮肤污染严重 泥沙、草屑、木屑、碎布屑、血液、污垢等混杂在一起 外加环境中的条件致病细菌可随着皮肤屏障受损入侵人体 如果不能及时清创 可能会导致严重的创伤后感染 一旦出现 需要及时、系统、规范和有效的治疗 否则感染极易扩散引起严重的并发症 例如组织肿胀压迫气道引起窒息 或向下发展成为纵膈感染 如菌血症、败血症、脓毒血症等引起多器官衰竭 危及患者生命 依据感染细菌类型针对性使用抗菌药物是 治疗的主要手段 在现有的治疗体系中 对于细菌类型的判断 主要依赖于传统的“脓液培养 药敏试验”该方法检测一般需要 在此期间治疗主要依赖于“经验用药”这也导致某些患者治疗效果差 耐药菌出现率高 传统方法同样不适用于快节奏的战时条件 因此急需寻求一种快速诊断感染细菌类型 指导抗菌药物使用的新方法气相色谱 质谱()是一种结合气相色谱和质谱的特性 鉴别出样本中各种挥发物成分的方法 作为一种高灵敏度和高通量的分析平台 已被证明是在各种应用中进行初级代谢研究的有用工具 通过鼓泡或者顶空的方法检测样本产生的挥发性有机化合物()的类型和峰面积 进一步分析得出样本的特异性化合物 并将其作为鉴定细菌类型的靶标物质 该检测方法耗时短、准确率较高、对设备依赖性低 为实现颌面部 细菌类型的快速诊断提供了可能本实验拟选取 中最常见的细菌类型金黄色葡萄球菌()作为研究对象 对其所产生的特异性靶标化合物()进行分析 建立 的特异性挥发物谱库 收集临床 患者的脓液 通过 技术分析其临床样本特异性靶标化合物()通过对 和 做一致性分析 结合传统脓液培养法结果 以评估 技术进行快速诊断 细菌类型的可能性(图)图 金黄色葡萄球菌与临床样本检测流程图 材料与方法 材料 标准菌株()购自北纳生物河南省工业微生物菌种工程技术研究中心 营养肉汤培养基()、琼脂粉购自青岛海博生物技术有限公司 联用仪(机体型号 热脱附型号)、吸附管(外径 空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/二苯呋喃多孔聚合物组成 吸附材料质量)购自日本 公司 色谱柱()购自日本岛津公司 方法 标准菌株的制备 吸取 菌悬液打入平板中 涂布均匀 将平板置于 培养 获得 的单菌落 用接种针挑取 的单菌落接种于 的营养肉汤培养基中 、/的摇床培养 重复获得多个 菌悬液 细菌培养顶空取样取上述制备的单一培养菌液体 加入含有 营养肉汤培养液的细菌培养瓶中 将密封的细菌培养瓶放置于 恒温培养箱培育 记录 值 并计算菌体数量 (为菌体量 为 值)用干燥氮气以/吹扫 培养瓶顶气体被捕获到 吸附管上 吹扫时间 空白样品除培养菌液改为营养肉汤培养液之外 其他步骤同上 获得 个 测试样品(、)个空白对照()样本(、)临床样品的制备临床随机纳入 例 患者 在手术过程中抽取脓液 将脓液以 /离心 去除细胞等固体沉淀 保留上清 随后 /离心 获得脓液中的菌体沉淀 重悬菌体进行显微镜计数 获得的菌体直接上机检测 一部分脓液送常规菌培养检验 检测参数 吸附管解析温度 解析时间 解析流量/冷阱温度 接口温度 阀温度 传输线温度 载气为高纯(纯度大于 )氦气 采用不分流进样模式 保持线速度/色谱柱流速/吹扫流量/梯度升温程序为 恒温 /升温到 再 /升温到 恒温 质谱条件为电子碰撞源温度 溶剂延迟时间为 扫描模式为 扫描速度为 /扫描范围为 特异性靶标物的选择 对 原始数据采用 软件进行峰提取、峰对齐、反卷积分析 进一步处理导出化合物及峰面积数据 采用单变量和 多 变 量 结 合 的 方 式 对 数 据 进 行 分 析 检验计算单变量显著性差异 得到 值 校正后获得错误发现率()以 和变化倍数()做 的 以及 的 火山图 快速直观地识别变化幅度较大且具有统计学意义的代谢物 将归一化数据进行多维统计分析 正交过滤偏最小二乘方 判别分析()的多变量分析方法 获得 与 的差异化合物变量投影重要性()排序 值 为两者的差异代谢物 值越大的化合物在两者中差异越大 用 时可认为化合物一致 在 种 中 与临床 对比计算出临床感染细菌类型与 的一致性 用以评估感染 的可能概率 根据 的特点本研究提出了基于细菌概率的 算法()计算法计算患者感染 的概率()将临床常规细菌培养结果作为金标准 验证 对于临床快速诊断的效果()(“”“”)()、为 和临床样 本:样本菌体数量:临床样本菌体数量:某一化合物峰面积:临床样本某一化合物峰面积:/结果 临床 患者信息 患者为通过随机纳入临床收治患者中诊断为间隙感染的患者 包括单间隙感染和多间隙感染纳入标准参考口腔 诊疗专家共识 准确记录患者性别、年龄以及基础疾病类型 特异性代谢物数据库的建立 获得 和空白培养基的色谱峰通过 技术分析 的挥发物以及 的 色谱峰(图)分析去除偏离样本的色谱峰获得 色谱峰 可以观察到 和 重复组一致性好:培养基色谱图:培养基色谱图:金黄色葡萄球菌:空白对照图 与 培养基色谱图 筛选获得 特异性化合物 将 获得的 个 和 个 结 果的原始 格式 数据用 软件转变为 格式 然后导入 软件进行分析 共检测出已知化合物 种 通过 检验获得其 值 选择校正后 值进行计算 当 或者当 为 特异性化合物 绘制火山图(图)获得二者之间差异物质化合物 又根据 降维分析发现 (绿色)与 (蓝色)之间有很好的区分(图)该 模型拟合优度好 符合标准:与 火山图 峰面积/峰面积 时认为化合物在两者之间没有差异(灰色)时为 特异性靶标化合物(红色)的化合物为二者差异性化合物:与 化合物得分图 越趋向两端的化合物认为其在 和 中差异越大:变化倍数:金黄色葡萄球菌:变量投影重要性图 与 培养基火山图、及 图空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/特 异性靶标谱 库的建立 根 据 检验获得的统计结果 根据 的化合物有 种 选择峰面积排序前 作为其特异性化合物 对其进行矫正并查找化合物名称 的特异性化合物种类及峰面积、保留时间、匹配度、编号见表 表 特异性挥发物峰面积、匹配度及保留时间化合物峰面积/匹配度/保留时间/编号化合物峰面积/匹配度/保留时间/编号二羟基苯甲酸 正二十九烷 羟基 二甲基黄酮醇 甲酸异丁酯 异戊醇 反 查耳酮 壬酮 糠醛 茚酮 正十四烷 二叔丁基过氧化物 丙二醇甲醚 二甲基三硫 甲基萘 正癸烯 肉桂醛 环戊烷 为未查出 编号 临床 患者感染细菌类型评估 患者色谱图在患者进行手术取脓后多次离心获得菌体沉淀 然后通过 分析 获得 患者的挥发物色谱图(图)并通过 软件分析发现 与 的 中一致的化合物峰面积(表)患者感染 概率预测 依据 的细菌数量与临床菌体样本的数量比值 计算获得 最终峰面积数据 将临床感染患者获得的 与 相比较 通过 公式计算以后获得临床感染患者感染 的概率(表)图 临床 患者色谱图表 位 患者 与 的 中一致的化合物峰面积()患者编号化合物峰面积二羟基苯甲酸 羟基 二甲基黄酮醇 反 查耳酮糠醛正十四烷丙二醇甲醚 甲基萘肉桂醛 患者编号化合物峰面积正二十九烷甲酸异丁酯异戊醇 壬酮 茚酮二叔丁基过氧化物二甲基三硫正癸烯环戊烷 为临床样本中未检出化合物:/表 临床结果预测患者编号/细菌培养结果感染 概率毗邻乏养菌 乳酸乳球菌 未检出 :样本菌体数量:临床样本菌体数量:金黄色葡萄球菌 讨论本研究首次提出了一种基于 技术的 和 的对比匹配算法模型 计算法 用于诊断 细菌类型 以往的研究仅通过比较细菌与细菌之间化合物的差异 提出通过 进行区分的可能性 一部分实验通过分析实验室细菌与细菌之间的化合物差异从而将细菌类型区分开来 使用方法包括吸气型离子迁移谱仪和气相色谱 质谱联用技术、/等多种方法 也有研究通过分析混合菌产生的化合物与单一培养细菌之间的差异 发现两者之间产生的化合物不同 该部分结果证实了实验室细菌能通过 进行有效区分 另一部分实验用于分析临床感染患者与健康人之间产生的挥发物是否具有差异性 等分析了精神病临床高危人群的血浆代谢改变和潜在生物标志物 等使顶空固相微萃取气质联用技术评估口臭和下颌下脓肿的唾液 使用的方法是气相色谱技术和唾液孵育试验相结合 取患者唾液在 孵育 后进行色谱质谱检测 发现正常患者与口臭患者以及间隙感染患者之间通过气味能进行有效区分 等用 分析肺炎克雷伯菌在临床肺炎患者中的挥发性化合物并且通过动态监测挥发物浓度的变化来预测肺炎感染的可能性 相关的临床实验结果都证实了 在临床应用的可能性 本研究将实验室和临床相结合通过 技术检测了 中常见细菌 的 根据 和 值选取了 种作为其特异性的靶标物 设计了 算法 将临床 患者的 带入计算得出其感染该细菌的可能性用以预测细菌类型 结果显示 份样本 感染的可能性分别是、实际细菌培养结果为毗邻乏养菌、乳酸乳球菌、未检出 提示基于 结果与实际细菌培养结果一致性较好 通过 预测 细菌类型是可行的本研究首次将 技术用于 细菌类型的快速诊断 将传统的 检测时间缩短至 该方法尤其适用于战时条件下的细菌类型快速诊断 由于战场的地域与时空的选择都在极端恶劣的自然地理、气象环境下进行 受伤后伤员可能会发生严重的创伤后感染 进而引起 现代战争具有突发性、不熟悉性、未预期性和高强度性等特点 对部队作战人员均会产生急性应激障碍和创伤后应激障碍等心理影响 这些影响在口腔颌面部可进一步表现为唾液分泌障碍(口干)、口腔菌群失调等症状 若该人员同时伴有口腔牙齿相关疾病 例如智齿冠周炎、龋齿、牙周炎、扁桃体炎或颌面部淋巴结炎等 平时可能暂时无影响的疾病会迅速转变成 合理使用抗菌药物是治疗 的主要方法 但由于受到“细菌培养 药敏试验”时间限制 早期 的抗菌药物选择主要采用“经验性用药”临床上 患者常规根据“经验性用药”进行抗菌药物的选择 该方法虽然具有一定的普适性 但个别患者也会出现效果不佳、后期出现耐药菌的问题 本研究将 细菌检测分为两步 第一步筛选 常见细菌 通过标准菌培养、检测、特异性靶标物确定等步骤 建立了该细菌的靶标物数据库 第二步在临床遇到 患者时 通过局部脓液抽吸或手术中收集患者脓液 之后进行标准化的离心、计数、提取、上机检测、数据分析等步骤 理论上可以在 之内得到细菌类型预测结果 通过将建库时间前移 进而缩短诊断时间 为早期及时使用抗菌药物治疗提供依据本研究探索了通过 技术进行 细菌类型快速诊断的可行性 但仍存在一些缺陷 首先 纳入的样本量较少 本研究只纳入了 种 常见细菌()和 例 患者样本 虽然结果符合预期但后期仍需尽快完善 细菌标准库 纳入更多患者样本进行验证 同时优化 算法 提高诊断的准确率 其次 临床上该方法仍不能完全取代“细菌培养 药敏试验”的方法 本研究提出的方法对于细菌类型的诊断是以“可能性”定义的 数学模型上只能得出感染某种细菌的“概率”用于抗菌药物选择的依据 在进行临床可靠性验证前仅限于科学研究再次 该研究并没有考虑多重细菌感染的情况 后期拟进一步纳入“需氧菌 厌氧菌”多重感染的情况分析该方法的可行性 最后 设备仍不够便携 不能满足战时需求 本研究团队前期已经通过采用基于 的小型化传感器应用于膀胱癌的检测 后期小型化 设备也是本研究方向之一本研究基于颌面部常见的感染性疾病 这一疾病模型 使用 技术对比标准菌 和患者 差异 通过统计学联合公式进行细菌类型的空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/快速诊断 拟为平时或战时快速确定 细菌类型提供理论依据【参考文献】刘媛 何怡蓓 王文博 美军在伊拉克和阿富汗战争中的战创伤感染情况.解放军预防医学杂志 ():钮燕 朱静 严久琼 恩格列净通过抑制 改善脂多糖诱导的高血糖和对心脏功能的影响.海军医学杂志():李云鹏 石冰 张浚睿 等 口腔颌面部间隙感染诊疗专家共识.中华口腔医学杂志 ():李惠芳 白岳飞 新生儿败血症相关性胆汁淤积症临床表现及危险因素分析.陕西医学杂志 ():赵小珩 郭威 张浚睿 等 口腔颌面部间隙感染的管理(一)经验用药策略.实用口腔医学杂志 ():.:张志愿 口腔颌面外科学.北京:人民卫生出版:.肖敏 杨峰 王旭荣 等 分光光度法测定金黄色葡萄球菌菌液浓度方法的建立.动物医学进展 ():.():.():().:.():/.():.:/.():.:石照辉 陈晓栋 李云鹏 等 颌面战创伤救治智能决策支持系统的构建(上).人民军医 ():石照辉 陈晓栋 李云鹏 等 颌面战创伤救治智能决策支持系统的构建(下).人民军医 ():.():.():(收稿 修回)(编辑:陈仕红)(上接第 页)杨淋 蓝海 多种天然药物对口腔常见致龋菌的研究进展.辽宁中医杂志 ():迟惠文 陶文韬 王子璇 等 中药防龋的研究进展.中国中医药现代远程教育 ():宁佳 胡欣 程兴群 变异链球菌氧化应激调控机制的研究进展.口腔疾病防治 ():张富华 管理霞 余晓沁 显微化学去龋技术临床及生物学研究.实用口腔医学杂志 ():.():.():.():.():.():(收稿 修回)(编辑:陈仕红):/