基于全基因组测序的贝莱斯芽胞杆菌Ba-0321抑菌机制分析及相关功能验证.pdf

39(4)885-894 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 8 月 收稿日期：2022-11-03 基金项目：河南省农业科学院科技创新团队专项项目（2022TD26）；中国烟草总公司河南省公司科技项目（2020410000270012，2022410000240018）作者简介：李小杰，博士，副研究员，E-mail：；*通信作者，研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.035 基于全基因组测序的贝莱斯芽胞杆菌Ba-0321抑菌机制分析 及相关功能验证 李小杰，邱 睿，刘 畅，姚晨虓，白静科，陈玉国，李淑君*（河南省农业科学院烟草研究所/烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室，许昌 461000）摘要：贝莱斯芽胞杆菌 Bacillus velezensis Ba-0321 是从健康烟株根际土壤中分离获得的一株具有较强抑菌活性的根际促生细菌，具有较好的生防潜力和应用前景。本研究采用菌丝生长速率法测定菌株 Ba-0321 无菌滤液对烟草尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 和疫霉菌 Phytophthora nicotianae 的抑制效果，采用二代illumina 与三代 Nanopore 相结合的测序技术，对菌株 Ba-0321 进行全基因组测序，并对测序数据进行基因组组装、基因功能注释及次级代谢产物合成基因簇预测等。结果表明，菌株 Ba-0321 无菌滤液对尖孢镰刀菌和疫霉菌均具有抑制效果，其中含有 10%无菌滤液的培养基对两种病原菌菌丝生长的抑制率较高，分别达 57.38%和 34.30%。全基因组测序结果表明，菌株 Ba-0321 基因组大小为 4099109 bp，共有编码基因 3897个，基因组测序数据提交至 NCBI 获得 GenBank 登录号为 CP101904。在 GO、COG 和 KEGG Pathway 数据库中有大量编码酶类、萜类化合物、聚酮化合物代谢途径和参与防御机制相关基因被注释。利用anti-SMASH 预测到 13 个次级代谢产物合成基因簇，编码 Surfactin、Fengycin、difficidin、Bacillaene、Bacillibactin、Macrolactin H、Bacilysin 等多种抑菌活性物质。通过 PCR 扩增和序列测定分析，证实了 Ba-0321菌株基因组中确实存在抑菌物质合成基因簇及防御机制相关基因。酶活测定结果表明，该菌株具有蛋白酶、几丁质酶和纤维素酶等抗性酶活性。本研究在基因组层面上解析了菌株 Ba-0321 的抑菌机制，为挖掘抑菌相关基因资源提供了分子基础，对该菌株的后续相关研究及应用具有重要意义。关 键 词：贝莱斯芽胞杆菌；全基因组；抑菌机制；功能注释；功能验证 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)04-0885-10 Antifungal Mechanism Analysis and Verification of Bacillus velezensis Ba-0321 Based on Whole Genome Sequencing LI Xiaojie,QIU Rui,LIU Chang,YAO Chenxiao,BAI Jingke,CHEN Yuguo,LI Shujun*(Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Green Preservation&Control of Tobacco Diseases and Pests in Huanghuai Growing Area,Xuchang 461000,China)Abstract:Bacillus velezensis Ba-0321,isolated from the rhizosphere soil of healthy tobacco plants,is a plant growth promoting rhizobacteria with strong antifungal activity.It has a good potential in biocontrol application.In the study,the inhibitory effects of strain Ba-0321 sterile filtrate on Fusarium oxysporum and Phytophthora nicotianae were determined by methods of co-culture.The whole genome of strain Ba-0321 was sequenced using the second-generation Illumina and the third-generation Nanopore platform,then analyzed for genome assembly,gene functional annotation,prediction of secondary metabolite synthetic gene clusters.The results showed that the sterile filtrate of strain Ba-0321 has inhibitory effects on both F.oxysporum and P.nicotianae.The culture medium containing 10%sterile filtrate has a higher inhibitory rate on the mycelial growth of the two pathogens,reaching 886 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 57.38%and 34.30%,respectively.The results of whole genome sequencing showed that the genome size of strain Ba-0321 was 4099109 bp,including 3897 coding genes,and the sequencing data are available in the GenBank database(accession No.CP101904).There were a large number of genes encoding enzymes,terpene,polyketone metabolic pathways,and genes involved in defense mechanisms have been annotated in the GO,COG and KEGG databases.Using anti-SMASH software,13 secondary metabolite synthesis gene clusters were predicted encoding antibacterial substances such as Surfactin、Fengycin、difficidin、Bacillaene、Bacillibactin、Macrolactin H、Bacilysin.The existence of biosynthetic gene cluster for antibacterial substances and defence machainsm related genes in Ba-0321 strain genome were verified by PCR amplification and sequencing.The enzyme activity test results showed that the strain has resistant enzyme activities such as protease,chitinase,and cellulase.This study provides a basis for analyzing the antimicrobial mechanism of strain Ba-0321 and mining antifungal related gene resources at the genomic level,which is of a great significance for research and application of the Ba-0321 strain in future.Key words:Bacillus velezensis;whole genome;antifungal mechanism;functional annotation;functional verification 芽胞杆菌 Bacillus spp.是一种嗜温、好氧、产芽胞的杆状细菌，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子、多种抗菌素和酶，具有广谱抑菌活性和极强的抗逆能力1,2。贝莱斯芽胞杆菌是芽胞杆菌中新发现的 1 个种，普遍存在于自然界植物组织、土壤、河水以及海洋中3-5。有研究表明，贝莱斯芽胞杆菌具有防治多种植物病害的潜力，同时具有促生、固氮和抗逆境等多种优良功能，是重要的生防资源。郗良卿等6从健康甜樱桃中筛选出优质拮抗菌株贝莱斯芽胞杆菌，能够抑制匍枝根霉 Rhizopus stolonifer的生长，对樱桃软腐病也有良好的防治效果；沙月霞等7明确了水稻内生菌贝莱斯芽胞杆菌B.velezensis E69是一种潜在的、预防效果明显的生防菌株，具有预防稻瘟病兼防纹枯病等多种真菌病害的应用潜力；夏明聪等8明确了贝莱斯芽胞杆菌 YB-145 是一株具有生防潜力的菌株，可用于小麦纹枯病的防控，同时能提高小麦根鲜质量、地上部鲜质量和地上部高度。芽胞杆菌主要通过两种途径产生抑菌物质，一是通过核糖体途径合成小分子物质如肽类物质、细菌素、硫肽类物质（thiopeptide）、萜烯类物质（terpene）等9,10，二是通过非核糖体途径合成的脂肽类化合物、聚酮类化合物和多肽类化合物等11,12。芽胞杆菌分泌的有益次生代谢产物种类繁多，但传统的试验分析和鉴定方法很难全面地分析其中的抑菌活性物质且耗时耗力，同时难以充分挖掘其相关基因，揭示其生防作用机制。全基因组测序为进一步认识和利用生防菌株提供了重要基础，尤其是随着测序技术的不断革新以及费用的大大降低，越来越多的芽胞杆菌基因组序列被公布。通过全基因组信息挖掘，研究者发现了大量已知或未知的抑菌物质合成基因簇。戴利铭等13对一株具有较强抑菌活性的内生解淀粉芽胞杆菌 BS-3 进行全基因组测序分析，预测得到 10 个次级代谢产物基因簇，其中包括 6 类已知的具有抑菌活性的物质和 4种功能未知的基因簇；高圣风等14从生防菌株 B.velezensis Z 全基因组信息中发现编码次生代谢产物合成的基因簇 13 个，其中有 5 个未知功能基因簇。这些研究结果不仅有助于解析芽胞杆菌次级代谢产物的合成途径，同时能挖掘新的次级代谢产物，为新型生物药物的开发提供重要资源。本课题组前期在健康烟株根际土壤中筛选到一株高效生防贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321，本研究测定了菌株 Ba-0321 无菌滤液对尖孢镰刀菌、疫霉菌等烟草主要病原真菌的抑制效果，同时利用第二代 illumina与第三代 Nanopore 相结合的测序技术对该菌株进行全基因组测序，通过 GO、COG、KEGG 和 antiSMASH等数据库进行基因功能注释和次级代谢产物基因簇分析，并进行相关功能验证，以期为全面深入解析其抑菌机制、挖掘次级代谢产物基因资源和菌株的高效开发利用提供生物信息学基础。1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株 贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 分离自河南省许昌市烟田健康烟株根际土壤，现保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏号 CCTCCM2020440）。第 4 期 李小杰等：基于全基因组测序的贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 抑菌机制分析 及相关功能验证 887 植物病原真菌：烟草尖孢镰刀菌 F.oxysporum、烟草疫霉菌 P.nicotianae 均分离自河南烟田发病烟株并保存于本实验室。1.1.2 主要试剂和仪器 细菌基因组 DNA 提取试剂盒，布鲁克(北京)科技有限公司；DL2000 DNA Marker，北京天根生化科技有限公司。PCR 仪，Applied Biosystems 公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；NanoDrop 2000，赛默飞世尔科技公司。1.1.3 所用培养基 贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 培养用 LB 培养基：蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水 1000 mL；尖孢镰刀菌培养用 PDA 培养基：马铃薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g，蒸馏水 1000 mL；疫霉菌培养用 OA 培养基：燕麦片 30 g，蒸馏水 1000 mL。固体培养基均添加琼脂粉 15 g/L。121 高压灭菌 20 min。酪蛋白培养基：干酪素 10.0 g，琼脂 20.0 g，pH 7.2；纤维素水解培养基：蛋白胨 10.0 g，KH2PO4 1.0 g，酵母浸粉 10.0 g，NaCl 5.0 g，羧甲基纤维素钠 10.0 g，琼脂 15.0 g，pH 7.2；几丁质培养基：胶体状几丁质 10.0 g，KCl 0.2 g，NH4H2PO4 1.0 g，MgSO47H2O 0.2 g，琼脂 20.0 g，超纯水 1000 mL。1.2 方法 1.2.1 菌株 Ba-0321 无菌滤液的抑菌能力测定 采用菌丝生长速率法，将菌株 Ba-0321 接种于 LB 液体培养基中，28、180 r/min 条件下恒温振荡培养 3 d，5000 r/mim 离心 10 min，取上清液用 0.22 mol/L 过滤器进行过滤除菌。分别按 1%、5%和 10%的比例将发酵滤液加入 PDA 或 OA 培养基后倒平板，将直径为 5 mm 的尖孢镰刀菌和疫霉菌菌块分别置于上述含有不同发酵滤液的平板中间，以不加滤液处理为对照，每个处理重复 3 次，25 恒温箱中培养 5 d，采用十字交叉法测量病原菌菌落直径并拍照，计算抑菌率，抑菌率（%）=（对照组菌落生长直径处理组菌落生长直径）/对照组菌落生长直径100。1.2.2 菌株 Ba-0321 全基因组测序 采用 SDS 提取结合纯化柱（OMEGA）法，提取基因组 DNA。利用Nanodrop、Qubit 和 0.35%琼脂糖凝胶电泳进行纯度、浓度和完整性质检，然后进行文库构建。采用二代illumina 与三代 Nanopore 相结合的测序技术进行测序。本次测序委托北京擎科生物科技有限公司完成。1.2.3 基因功能注释 将预测得到的基因序列与 GO（Gene Ontology）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）等数据库做 BLAST+(2.9.0+)比对，得到基因功能注释结果。1.2.4 抑菌代谢产物分析 采用 antiSMASH 程序（version 5.2.0）对菌株 Ba-0321 中次级代谢产物合成基因簇进行预测。结合基因注释结果和 NCBI 数据库 BLAST 比对分析结果，挖掘菌株 Ba-0321 可能具有抑菌活性的次级代谢产物及编码基因簇。1.2.5 抗菌脂肽合成基因及防御机制相关基因的 PCR 扩增 根据相似度高的已知芽胞杆菌基因组中 Surfactin、Macrolactin、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacillaene 和 Bacilysin 脂肽抗生素合成基因（表 1）及Ba-0321 菌株基因组中预测的防御机制相关基因（表 2）设计引物，以 Ba-0321 基因组 DNA 为模板进行 PCR扩增。PCR 反应体系：2Taq PCR Mix 12.5 L，10 mol/L 正、反向引物各 1 L，基因组 DNA 1 L（50 ng）为模板，超纯水补足至 25 L。PCR 扩增条件为：95 预变性 5 min；94 变性 45 s，54 退火 40 s，72 延伸 50 s，30 个循环；72 延伸 8 min，4 保存。PCR 反应结束后，取 5 L 扩增产物于 1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，在 BIO-RAD 凝胶成像系统上观察、拍照。将获得预期大小的 PCR 扩增产物送测序，测序所获得的序列在 NCBI 中进行 BLAST 比对分析。1.2.6 菌株 Ba-0321 产酶能力测定 将菌株 Ba-0321 在 LB 培养基上进行活化并划线培养，挑取单菌落接种于 LB 液体培养基中 28、160 r/min 振荡培养至 OD6001.0，吸取 5 L 菌液分别点接于酪蛋白培养基、纤维素水解培养基和几丁质培养基上，28 恒温培养 35 d，观察上述培养基是否产生水解圈，以检测菌株是否具有蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶活性。对照滴加等量 LB 培养液，每个处理 3 次重复。2 结果与分析 2.1 贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 无菌滤液对烟草尖孢镰刀菌和疫霉菌的抑菌能力 试验结果表明，菌株 Ba-0321 无菌发酵滤液对尖孢镰刀菌和疫霉菌均具有抑制效果，但不同添加量对 888 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 表 1 抗菌脂肽合成基因的引物序列 Table 1 Primer sequence of antibacterial lipopeptide synthesis gene 抗菌脂肽 Antibacterial lipopeptide 引物名称 The name of primer 引物序列 The sequence of primer(5-3)扩增片段长度 Amplified fragment length(bp)F：TTCGGCACAGTCGTTTCC sfrAC R：TGTCCTTACCCGCACCTT 715 F：GCGAATGTGCTCCTGACT Surfactin sfrAA R：GACTTCCGTATTGCTGACC 681 F：GTCCATACATCCCAGCAA pks2C R：GTCTTCCATCGGTTCCCT 862 F：TCTAACTATACGGCAAGACC Macrolactin pks2A R：ACGATACTTTGAGGAGGC 785 F：TACTGGGAGCGATACCTTG fenD R：CGAGAACTTGGGAGACGA 694 F：CGGCTCCTTACAGTTCTTA Fengycin fenB R：CTTTCGGTTTGCTTCCAG 589 F：AAAGAAACAATGCCACCG difG R：GTCAGCCACTCCTCAACG 722 F：TGCCGTCCCATTACCTAT Difficidin difA R：TAACCGTGCTTCTCCATC 738 F：CCGACCGCATTTCTTACA Bacillibactin dhbF R：CCCTTCAGCCCTTCTTCA 673 F：ATAGTGCCAGCCATACAAC baeD R：TCCCGAGATGACAAAGTG 620 F：ATCCGTATTCCAACCTTC Bacillaene baeC R：AGTGGATTCCGTCTTGCT 570 F：ACGCCATTACGACCAACA bacD R：TGCGATGTCTCCGTGAAT 523 F：CGTCCGTCAGAGGAGATA Bacilysin bacB R：CTGTTCATTGCGGTGTTT 422 表 2 防御机制相关基因的引物序列 Table 2 Primer sequences of resistance related genes 编码基因 Coding gene 引物名称 The name of primer 引物序列 The sequence of primer(5-3)扩增片段长度 Amplified fragment length(bp)F：AGGCGAATCTTCTGGAAT Uncharacterized conserved protein YaaN UN R：CGTAACAATGGAGGACTGA 599 F：GCAAAGAAATCAAGCGAACT ABC-type antimicrobial peptide APTS R：CGGCAGTGTAAGGCGTAT 622 F：ATGACGCTATCGGCTTAC Glutathione peroxidase GP R：GGTGACATTACCGTTTCG 369 F：CCATAACAGCCCAAATAC mRNA-degrading endonuclease mDE R：AATCAATGAGTGCCAAAC 210 F：TGGCTGCTGTTATTTATTGC Multidrug transporter EmrE EmrE R：CGATGACACCGATGAGGAT 289 F：AAAGCTCGAACATGCTACA Organic hydroperoxide reductase OHR R：TTGAATACGGACAGACACC 260 第 4 期 李小杰等：基于全基因组测序的贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 抑菌机制分析 及相关功能验证 889 病原菌的抑制效果不同。在相同体积的培养基中，无菌滤液所占比例越高，抑菌效果越明显。其中 10%无菌滤液处理对两种病原菌菌丝生长的抑制率较高，分别可达 57.38%和 34.30%，极显著高于 1%和 5%无菌滤液处理。5%无菌滤液处理对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率极显著高于 1%无菌滤液的抑菌率；而 5%无菌滤液处理对疫霉菌菌丝生长的抑制率与 1%无菌滤液处理无显著差异。以上结果表明，菌株 Ba-0321 能够产生具有抑菌活性的次生代谢产物，且抑菌活性与代谢产物的含量呈正相关（图 1）。抑菌率 Inhibition rate(%)注：图中不同小写字母表示 P0.05 水平差异显著；不同大写字母表示 P0.01 水平差异显著。Note:Lower case letters above the bars denote a significant difference at P0.05;Capital Letters above the bars denote a significant difference at P0.01.图 1 菌株 Ba-0321 无菌滤液不同添加量对烟草疫霉菌和尖孢镰刀菌的抑制效果 Fig.1 Antifungal effects of strain Ba-0321 against P.nicotianae and F.oxysporum 2.2 贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 全基因组组成 菌株 Ba-0321 全基因组大小为 4099109 bp，平均 GC 含量为 46.31%；含有基因 4103 个，其中编码基因 3897 个，平均长度 932 bp；含有 tRNA 基因 86 个，23S rRNA、16S rRNA 和 5S rRNA 各 9 个，tmRNA基因 1 个，miscRNA 92 个。预测出基因岛 10 个；前噬菌体 2 个；重复序列 202 个，覆盖率为 0.45%。Ba-0321基因组测序数据提交至 GenBank，登录号为 CP101904，基因组圈图见图 2。图 2 贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 基因组圈图 Fig.2 Genome circle map of B.velezensis Ba-0321 890 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 2.3 菌株 Ba-0321 基因组的 GO 功能注释 将菌株 Ba-0321 氨基酸序列与 GO 数据库进行比对，共得到 2992 个注释编码基因，占基因总数的72.92%，分别按照生物学过程（Biological Process）、细胞组分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）3 个方面进行注释（图 3）。分类统计结果显示，在生物学过程方面，其中有 56 个基因被注释到抗生素生物合成过程分类中；在分子功能方面，其中有 68 个基因被注释到水解酶活性分类中。另外，菌株 Ba-0321 含有纤维素酶、几丁质结合蛋白等拮抗活性相关基因和脂多糖生物合成、水杨酸生物合成、乙酰乳酸脱羧酶、乙酰乳酸合酶等诱导抗病性相关基因。以上结果表明，菌株 Ba-0321 可通过产抗生素、酶类和诱导植物产生抗病性等途径起作用。图 3 GO 功能分类 Fig.3 Gene ontology classification 2.4 菌株 Ba-0321 基因组的 COG 功能注释 对菌株 Ba-0321 基因组中具有生物学功能的蛋白编码基因进行 COG 注释，结果发现共有 2540 个蛋白编码基因被注释（图 4），占基因总数的 61.91%，可分为 AZ 共 24 类。其中注释到氨基酸转运及代谢（Amino Acid Transport and Metabolism）的基因最多，共 306 个，占总注释基因数的 12.04%；其次为翻译、核糖体结构和生物合成的注释基因数为 204 个，占比为 8.03%；碳水化合物转运和代谢、转录及未知功能基因分别有 191 个、188 个和 185 个。值得注意的是，有 62 个参与防御机制（defence machainsm）的基因被注释，其中编码 ABC 型多药转运系统基因最多，有 21 个；其次，编码多药转运蛋白基因 6 个，编码 ABC 型抗菌肽转运系统基因和肽酶基因各 5 个；编码焦磷酸酶水解酶基因 3 个，编码参与碲酸盐抗性的非特征性保守蛋白基因 2 个。推测这些基因可能参与了菌株 Ba-0321 的抑菌功能。2.5 菌株 Ba-0321 基因组的 KEGG 功能注释 将菌株 Ba-0321 与 KEGG 数据库进行比对分析，对应到 KEGG Pathway 的基因有 1168 个，占基因总数的 28.47%，参与 28 条代谢通路，其中基因数超过 50 的代谢通路有 15 条（图 5）。KEGG 富集分析结果表明，碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、Global and overview maps 和氨基酸代谢（Amino acid 第 4 期 李小杰等：基于全基因组测序的贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 抑菌机制分析 及相关功能验证 891 图 4 COG 结果分类图 Fig.4 Classification diagram of COG results 图 5 KEGG pathway 结果分类图 Fig.5 Classification diagram of KEGG pathway results 892 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 metabolism）是最主要的 3 种代谢通路，分别有 377、289 和 289 个基因被注释。另外，有 35 个基因被注释到其他次级代谢产物生物合成途径，有 56 个基因被注释到萜类化合物和聚酮化合物代谢途径，推测这些基因与 Ba-0321 抑菌活性物质的产生具有密切关系。2.6 次级代谢产物预测分析 利用 anti-SMASH 对菌株 Ba-0321 基因组进行次级代谢产物分析，结果发现该菌株共编码 13 个次生代谢产物合成基因簇，其中能够找到完全相同或相似度达 90%以上的已知基因簇 7 个，相似度在 20%以下的有 2 个基因簇，另外有 4 个基因簇未能找到与之相似的已知基因簇（表 3）。发现有 7 种抗菌活性物质，分别为表面活性素（Surfactin）、大环内酯类抗生素（Macrolactin H）、多烯类（Bacillaene）、丰原素（Fengycin）、聚酮类化合物 difficidin、儿茶酚型嗜铁素（Bacillibactin）和溶杆菌素（Bacilysin），除 Surfactin 与已知菌株 BGC0000433 来源的 Surfactin 合成基因簇相似性为 91%，其他 6 种抗菌素合成基因簇与已知菌株来源的与之对应的基因簇相似性均达 100%。Cluster 1 与已知菌株 BGC0000926 来源的 rhizocticin A 合成基因簇相似性较小，为 22%，Cluster 3 与已知菌株 BGC0000693 来源的 butirosin A/B 合成基因簇相似性最小，仅为7%。比对还发现该菌基因组中存在 4 种未知功能的基因簇（Cluster 4、8、9、12），其中萜类（Terpene）2 种，T3PKS（Type III PKS）类 1 种、非核糖体肽合成酶（NRPS）1 种。以上结果表明，菌株 Ba-0321中存在多种产生抑菌次生代谢产物的基因簇，同时也存在合成新抑菌物质的基因簇，具有较大的生防应用潜力。表 3 菌株 Ba-0321 次级代谢产物合成基因簇 Table 3 Gene clusters of secondary metabolite of Ba-0321 区域 Region 类型 Type From To 相似基因簇 Most similar known cluster 相似菌株 Similarity strain Region 1 NRPS，transAT-PKS 197，825 275，441 rhizocticin A BGC0000926(22%)Region 2 NRPS 374，687 439，596 surfactin BGC0000433(91%)Region 3 PKS-like 982，285 1，023，529butirosin A/butirosin B BGC0000693(7%)Region 4 terpene 1，109，119 1，126，337-Region 5 transAT-PKS 1，441，583 1，527，956macrolactin H BGC0000181(100%)Region 6 transAT-PKS，T3PKS，transAT-PKS-like，NRPS1，755，440 1，864，329bacillaene BGC0001089(100%)Region 7 NRPS，transAT-PKS，betalactone，bacteriocin1，933，325 2，066，121fengycin BGC0001095(100%)Region 8 terpene 2，131，499 2，153，382-Region 9 T3PKS 2，220，336 2，261，436-Region 10 transAT-PKS-like，transAT-PKS 2，419，278 2，525，457difficidin BGC0000176(100%)Region 11 NRPS，bacteriocin 3，150，810 3，201，956bacillibactin BGC0000309(100%)Region 12 NRPS 3，489，844 3，558，273-Region 13 other 3，762，569 3，803，987bacilysin BGC0001184(100%)2.7 菌株 Ba-0321 基因组中抗菌脂肽合成基因和防御机制相关基因的扩增 根据菌株 Ba-0321 全基因组序列中编码 Surfactin、Macrolactin、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacillaene 和 Bacilysin 脂肽合成酶基因（表 1）及防御机制相关基因（表 2）所设计的特异引物，以 Ba-0321基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，均能扩增出明亮且单一的条带，且片段大小与预期一致（图 6）。序列分析结果表明，扩增获得的 PCR 产物序列与设计的目标基因片段序列同源性均为 100%，与数据库中其他 B.velezensis 菌株基因组中相对应的基因序列同源性在 91%100%，进一步证实了菌株 Ba-0321 基因组中确实存在抑菌活性物质合成基因簇及防御机制相关基因。2.8 菌株 Ba-0321 产蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶的能力 酶活性测定结果表明，菌株 Ba-0321 可使酪蛋白培养基、几丁质培养基产生水解圈，显色反应中使纤维素刚果红培养基红色消失，产生透明圈，说明该菌株具有产蛋白酶、几丁质酶和纤维素酶的能力（图 7）。第 4 期 李小杰等：基于全基因组测序的贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 抑菌机制分析 及相关功能验证 893 20001000750500250100bp M：DL2000 DNA Marker；119：分别为引物 bacB、bacD、baeC、difG、pks2A、pks2C、fenB、fenD、APTS、EmrE、GP、UN、mDE、OHR、sfrAC、sfrAA、difA、dhbF、baeD 的 PCR 扩增结果 PCR amplification results of primers for bacB、bacD、baeC、difG、pks2A、pks2C、fenB、fenD、APTS、EmrE、GP、UN、mDE、OHR、sfrAC、sfrAA、difA、dhbF、baeD 图 6 抗菌脂肽和抗性相关基因的 PCR 扩增结果 Fig.6 PCR amplification results of antimicrobial lipopeptide and resistance related genes a：酪蛋白培养基 Casein medium；b：纤维素刚果红培养基 Cellulose-congo red medium；c：几丁质培养基 Chitin medium 图 7 蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶活性测定 Fig.7 Determination of protease,cellulase and chitinase activities 3 讨论 贝莱斯芽胞杆菌能分泌产生酶、抗菌蛋白、脂肽类抗生素、聚酮类抗生素、植物激素等多种生物活性物质，对抑制病原菌起着重要作用9,15。本研究通过共培养的方法明确了贝莱斯芽胞杆菌 Ba-0321 无菌滤液对尖孢镰刀菌和疫霉菌菌丝生长的抑制作用，说明该菌株可分泌胞外抑菌代谢产物，同时发现其胞外代谢产物的含量与抑制率的正相关性，但未明确其抑菌物质的种类。进一步通过全基因组测序及基因功能注释，从分子生物学的角度推测出一些与其抑菌功能相关的基因，如编码肽酶、水解酶、多药转运蛋白、纤维素酶、几丁质结合蛋白、抗生素生物合成等基因，以及参与萜类化合物、聚酮化合物代谢途径的基因等，同时推测出菌株 Ba-0321 基因组中还含有诱导抗病性相关基因，表明菌株 Ba-0321 可能通过多种途径抑制病原菌的生长，这与前人的研究9,15基本一致。通过对该菌株基因组中抑菌相关基因的分子验证和抗性相关酶活力测定16，进一步证实了该基因组测序结果的可靠性，初步明确了该菌株的抑菌机制。下一步将进行抑菌相关基因挖掘、胞外抑菌活性物质的分离提取及微生物农药的研发与利用。本研究采用 antiSMASH 工具预测菌株 Ba-0321 的次级代谢产物基因簇，得到脂肽类和聚酮类抗生素合成基因簇13个，