基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫MIC3抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45,No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211011基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫 MIC3 抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估张韧哲,孙倩,李婉婧,黄欣怡,张儒新,曾欢,郑亚东,宋厚辉,王璞*,程昌勇*(浙江农林大学 动物科技学院动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作
2、基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室,浙江 杭州 311300)摘要:本实验室前期构建的基于毒力基因改造的减毒单增李斯特菌(LM-1)被证实是一种较为安全的疫苗载体。为构建表达鸡柔嫩艾美耳球虫()毒力蛋白MIC3的重组减毒单增李斯特菌(LM)疫苗候选株并评估其对雏鸡的免疫保护效果,本研究在LM-1基础上采用同源重组的方法将MIC3蛋白关键功能区(aa159aa252)编码基因(475 bp756 bp)定点整合至LM-1基因组中,并与LM溶血素O(LLO,其编码基因为)融合表达获得重组LM-1-MIC3菌株并经PCR鉴定;western blot检测LM-1-MIC3中MIC3和LLO的表达
3、;测定细菌体外生长曲线检测LM-1-MIC3的体外生长能力;将野生菌株EGO-e、LM-1、LM-1-MIC3分别感染雏鸡72 h和144 h后,分别剖杀,取各组雏鸡肝脏和脾脏,经菌落计数对雏鸡肝脾载菌量进行测定并评估LM-1-MIC3在雏鸡体内的增殖能力;将野生株EGD-e、LM-1和LM-1-MIC3感染雏鸡并结合临床症状及致死率评估LM-1-MIC3对雏鸡的安全性;将LM-1-MIC3免疫雏鸡并建立感染模型,研究其对雏鸡抗球虫感染的免疫保护效果。PCR鉴定结果显示正确构建重组菌株LM-1-MIC3;western blot结果显示LM-1-MIC3分泌的融合蛋白LLO-MIC3能够在培养
4、上清液中大量表达;细菌体外培养结果显示LM-1-MIC3体外生长能力与EGD-e和LM-1无显著差异,表明融合LLO的MIC3不会影响LM-1的生长;雏鸡肝脾载菌量测定结果显示,与EGD-e组相比,各时间段LM-1-MIC3组雏鸡肝脾载菌量均极显著降低(0.01),感染LM-1-MIC3后雏鸡均存活且无明显临床症状,表明LM-1-MIC3对雏鸡致病力高度减弱,可以作为减毒疫苗载体;免疫保护试验结果显示在攻虫10 d后,LM-1-MIC3免疫组雏鸡的存活率高于LM-1免疫组及PBS对照组,且该组鸡无明显临床症状,剖杀后盲肠病变评分极显著低于LM-1和PBS组(0.001),表明LM-1-MIC3
5、对雏鸡有良好的免疫保护效果。本研究构建了重组减毒株LM-1-MIC3,并证实该重组菌对雏鸡具有较好的免疫保护效果,为减毒LM载体疫苗在防控重要动物传染病中的研究与应用奠定了科学基础。关键词:柔嫩艾美耳球虫;减毒单增李斯特菌;疫苗;免疫预防中图分类号:S852.6文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)06-0628-07Immunoprotective evaluation of an attenuated-basedvaccine bydelivering the MIC3 antigenZHANG Ren-zhe,SUN Qian,LI Wan-jing,HUANG Xin-
6、yi,ZHANG Ru-xin,ZENG Huan,ZHENG Ya-dong,SONG Hou-hui,WANG Pu*,CHENG Chang-yong*收稿日期:2022-11-07基金项目:浙江省自然科学基金面上项目(LY22C180001);浙江农林大学大学生创新创业训练项目(DKDY2022008、DKDY2022005);浙江农林大学校级学生科研训练项目(S202210341063)作者简介:张韧哲(1997-),男,湖南醴陵人,硕士研究生,主要从事预防兽医学方向研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding author(College of Animal Sc
7、ience and Technology&College of Veterinary Medicine,Zhejiang A&F University,Key Laboratory ofApplied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province,Zhejiang Provincial Engineering Research Center forAnimal Health Diagnostics&Advanced Technology,Zhejiang International Science a
8、nd Technology Cooperation Base for Veterinary Medicineand Health Management,China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics,Hangzhou 311300,China)Abstract:Attenuated(LM-1)based on the virulence gene modification constructed in our laboratoryhas been proved to be a relatively sa
9、fe vaccine vector.To construct a recombinant attenuatedvaccine candidate strainexpressing the invasive virulence protein MIC3 of(),and evaluate its immune-protective effect on chicks.In this study,homologous recombination was used to integrate the MIC3 protein key function region(aa159-aa252)coding
10、gene(476bp-756bp)into the genome of LM-1,and then merge the genes LLO and MIC3 to obtain the recombinant attenuatedLM-1-MIC3 strain.the fusion expression of MIC3 and LLO in LM-1-MIC3 strain were detected by western blot.The growthcurves of bacteriawas measured to detect the growth ability of LM-1-MI
11、C3.The proliferation ability of LM-1-MIC3 inchicken was evaluated by detecting the bacterial load in liver and spleen.The safety of infected wild strains EGD-e,LM-1 andLM-1-MIC3 was evaluated in combination with clinical symptoms and mortality of chicken.The mild strains EGD-e,LM-1 andLM-1-MIC3 infe
12、cted chicks for 72 hours and 144 hours,respectively.The chicks were slaughtered and the livers and spleens wereremoved from each group.The protective effect of LM-1-MIC3 againstinfection was detected by oral immunization ofchicken with LM-1-MIC3.The result of PCR showed that the LM-1-MIC3 strain was
13、 successfully constructed.Western blot resultsshowed that LLO-MIC3,a fusion protein secreted by LM-1-MIC3,was highly expressed in the culture supernatant.The result ofculture showed that the growth curve of LM-1-MIC3 was consistent with that of wild type of LM EGD-e and LM-1,indicating that MIC3 did
14、 not affect the growth of LM-1.The bacterial load in liver and spleen of chicken after LM-1-MIC3infection was significantly decreased compared with that after EGD-e infection(0.01).The chicken infected with LM-1-MIC3 allsurvived and showed no obvious clinical symptoms,indicating that LM-1-MIC3 has a
15、 highly weakened pathogenicity to chicks,andcan be used as a attenuated vaccine carrier.The survival rate of chicken 10 days after LM-1-MIC3 immunized chicken was higherthan LM-1 and PBS immunized with no obvious clinical symptoms,and after LM-1-MIC3 immunized cecal lesion value wassignificantly low
16、er than that of LM-1 and PBS immunized(0.001),which indicated that oral immunization of chicken withLM-1-MIC3 showed significant protection againstinfection.In conclusion,the recombinant attenuated LM-1-MIC3 wasconstructed,and showed a promising immune protection effect againstinfection,which laid a
17、 scientific foundation for thefuture development and application of attenuated-based vaccines in the prevention and control of importantanimal infectious diseases.Key words:;attenuated;vaccine;immuno-protection鸡球虫病严重危害养禽业,目前国内外通常采用抗球虫药控制球虫感染,但抗球虫药的残留问题难以得到解决,且新药研发成本高、研发周期长,限制了抗球虫药的应用1-2。目前球虫疫苗是替代药物防
18、治球虫病的有效措施,随着DNA重组技术的发展和应用,细菌活载体疫苗的研制日益成为防治球虫病的研究热点3-4。有报道称,雏鸡注射鸡柔嫩艾美 耳 球 虫()ADF 基 因 重 组 卡 介 苗pMV261-ADF和pMV361-ADF后,对的抵抗力稍有增强5-6。雏鸡口服表达5401重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门菌后,体内淋巴细胞增殖水平上升,并产生了球虫抗体7。表达MIC3和AMAI蛋白的减毒沙门氏菌活载体疫苗能够对球虫的感染提供一定的抵抗作用8。减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的艾美耳球虫DNA疫苗能够提高雏鸡免疫应答水平从而产生一定的免疫效果9。但目前并无抗的对雏鸡有较强免疫保护效果的减毒细菌疫苗。单增李斯特
19、菌(,LM)是一种革兰阳性胞内寄生菌,该菌可以引起人和动物的脑膜炎、败血症等10。LM被细胞吞噬后,在吞噬体内LM分泌毒力因子溶血素(LLO),进而逃逸至细胞胞浆,因此LM能够诱导宿主强烈的CD8+T细胞免疫和CD4+T细胞免疫应答11-12。因此LM具有作为疫苗张韧哲,等.基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫 MIC3 抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估第 6 期629载体递呈抗原的潜力13-14。目前,以重组LM作为疫苗载体递呈病毒或肿瘤抗原已被广泛研究,如流感病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、人类乳 头瘤 病毒 HPV-16 E7、人类 免疫 缺陷病 毒 HIVgag、酪氨酸
20、酶相关蛋白(Trp2)、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu等15-16。此外,LM-LLO-E7目前已被应用于临床试验,实验中接受重组减毒LM疫苗的患者体内产生了较强的特异性免疫应答,存活时间高于未接受疫苗的患者,以上研究显示重组减毒LM具有很好的应用前景17。本实验室前期构建了重组减毒LM株LM-1,发现其表达的LLO突变体蛋白几乎无溶血活性,且其在小鼠模型中的致病力显著低于野毒菌株EGD-e。本研究利用同源重组的方法将MIC3关键抗原功能区(aa159aa252)编码基因整合至LM-1的(LLO编码基因)基因下游并克隆至穿梭载体pKSV7中构建重组质粒,并转化LM-1感受态细胞
21、,通过42 和氯霉素筛选获得表达LLO-MIC3融合蛋白的重组减毒LM,饲喂雏鸡后对其免疫保护效果进行评价,为预防提供新思路。1材料与方法1.1主要实验材料LM野生株EGD-e、大肠杆菌DH5琢感受态细胞、LM-1(本实验室前期构建的毒力基因改造的LM)、LM-1基因组、LM-1感受态细胞、温敏穿梭载体pKSV7均由本实验室保存;雏鸡购自杭州萧山东海养殖有限责任公司;BHI培养基购自Oxoid公司(英国);羊LLO多抗为本实验室自制;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;氯霉素、SDS、三氯乙酸、DAB缓冲液、包涵体蛋白提取试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司;羊抗兔Ig
22、G购自爱必信上海生物科技有限公司;HiScriptRIII RT SuperMix for qPCR、FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。1.2引物的设计与合成从NCBI数据库下载LMLLO编码基因序列(987033)、基因序列(KM018021),利用Snapgene软件在基因C端500 bp和下游500 bp处分别设计引物TYB-A-a/b和TYB-B-a/b,以扩增基因上下游同源臂片段A和B。同时在基因两端设计引物MIC3-F/R,以扩增获得MIC3关键功能区aa159aa252编码基因(47
23、5 bp756 bp)片段(MIC3aa159aa252)。在上游同源臂片段A的上游80 bp处设计引物A-front,作为重组菌株的遗传标记。另合成pKSV7通用引物pKSV7-fwd/rev,作为pKSV7质粒丢失的遗传标记。以上引物均由擎科生物科技有限公司合成(表1)。1.3重组质粒的构建与鉴定以LM-1基因组为模板,TYB-A-a/b和TYB-B-a/b为引物进行PCR扩增,以获得基因上游同源臂片段A和下游同源臂片段B;利用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation KitV2提取子孢子RNA,并反转录为cDNA,以cDNA为模板,MIC3-F/R
24、为引物进行PCR扩增,以获得片段;经重叠延伸PCR将上游同源臂片段A和下游同源臂片段B与MIC3片段融合,并克隆于质粒pKSV7中,转化至大肠杆菌DH5琢感受态细胞中,提取质粒,由北京擎科生物科技股份有限公司测序鉴定正确后的重组质粒命名为pSL1690(图1)。1.4重 组 菌 株 LM-1-MIC3 的 筛 选 与 鉴 定将pSL1690电转化LM-1感受态细胞中,并涂布于含有氯霉素的BHI固体培养基上(pKSV7载体中含氯霉素抗性基因),于42 同源重组。对生长的菌落连续表 1引物信息引物名称Primer namesTYB-A-aTYB-A-bTYB-B-aTYB-B-bMIC3-FMIC
25、3-RA-frontpKSV7-fwdpKSV7-rev引物序列(5-3)Primer sequencesCCAAGCTTGCATGCCGGAGACTTACGCGATATTTTGAAAAAAGGCCCTGTCCAGCCGCCGGAGCCGCCTAAGCTAATTGTAAAAGTAATAAAAAATTAAGAATAAAACCGCTTAACACACACACATGATTACGAATTAAATCTTTTGCTTCGCAGGAATCTGGCGGCGGCTGGACAGGAAGTGCGCACAGTTTTACAATTAGCTTTTGTCGCTGTCAATGACCTCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAG
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