基于网络药理学研究四物汤对阿尔茨海默病的作用机制及实验验证.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金项目();中央高校基本科研业务费专项资助项目();中医药传承与创新“百千万”人才工程项目(岐黄工程)岐黄学者项目;国家重点研发计划项目()基于“道术结合”思路与多元融合方法的名老中医经验传承创新研究作者简介:张秀文(),女,博士研究生在读,研究方向:脑病,:通信作者:时晶(),女,博士,主任医师,研究方向:脑病,:中药研究基于网络药理学研究四物汤对阿尔茨海默病的作用机制及实验验证张秀文魏明清倪敬年李婷时晶田金洲(北京中医药大学东直门医院,北京,)摘要目的:基于网络药理学方法,探讨四物汤治疗阿尔茨海默病()的作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库()得到四物汤中药物的
2、化学成分,并预测其作用靶点,使用 构建成分 靶点图,从 和 数据库得到 的疾病靶点,构建蛋白质相互作用网络(),进行基因本体()与基因相互作用()富集分析;并通过体外细胞实验进行初步验证。结果:网络药理学研究共得到四物汤活性成分 个,潜在靶点 个。构建 网络并进行拓扑学分析,前 位核心靶点有蛋白激酶 ()、胱天蛋白酶 ()、原癌基因()、肿瘤坏死因子()、前列腺素内过氧化物合酶 ()。富集结果显示,其主要与神经元凋亡过程的正调控等生物过程有关,可能作用于细胞凋亡、样受体()信号通路等。体外实验显示,四物汤能够显著增加 细胞淋巴瘤 ()的表达。结论:本研究说明了四物汤对 多靶点、多通路的整体调节
3、特点,总结了应用四物汤的理论依据,初步揭示了可能的分子机制,为后续的临床应用和实验研究以更进一步的理论支持。关键词阿尔茨海默病;四物汤;网络药理学;血证;作用机制;中医;细胞;凋亡 :,(,):():(),()(),()():(),(),(),(),()():,;中图分类号:;文献标识码:阿尔茨海默病(,)是一种慢性进行性的神经退行性疾病,是导致痴呆的最常见的原因,占痴呆患者总数的 。年国际阿尔茨海默病协会估计:全世界有超过 万的痴呆症患者,到 年将增加到 亿 。随着老龄化社会的到来,预测 年我国的患病人数将超过 万 。这将给社会、医疗和家庭带来沉重的负担。同时,的发病机制尚未完全明确,目前已
4、知的发病机制有 淀粉样蛋白(,)异常沉积、蛋白过度磷酸化导致的世界中医药 年 月第 卷第 期神经纤维缠结(,)、神经炎症反应、线粒体功能障碍、氧化应激以及细胞凋亡等 。但不幸的是,针对单一发病机制的一系列药物研究在临床试验阶段都没有获得很好的临床效果 。故而目前认为 是由多因素共同作用引起的,治疗也应当针对多种因素进行多靶点治疗。中医以整体观念和辨证论治为基本特点,是一种多靶点治疗的方法,随着近年来国外药物研究的失败,中医疗法受到了广大医务工作者的关注。阿尔茨海默病是由髓减脑消、神机失用所导致的神智异常疾病,属于中医学的“痴呆病”,临床以呆傻愚笨、智力低下、善忘等为主要表现 ,病性为本虚标实,
5、本虚在于肾精不足,标实在于痰浊、瘀血蒙蔽脑窍 。阿尔茨海默病的中医诊疗共识 指出 早期以肾虚为主;中期痰、瘀、火并现;晚期为痰、瘀、火日久而化生毒浊所致,治疗方面当遵循补肾原则,分期辨证治疗 。四物汤,出自宋代的 太平惠民和剂局方,主要记载用于妇产科疾病,主要作用为补血和活血,由熟地黄、白芍、当归、川芎等中药组成,逐渐被后世医家认为“可治一切血证”“血证立法”。基于现代药理研究和临床应用研究,基于“虚”“瘀”的病机,四物汤被认为可用于多类病的治疗 。本文探析从“血”论治 的理论依据,并利用网络药理学方法对“调理一切血证”的四物汤用于 的作用机制进行全面研究 ,为后续研究的开展提供依据。材料与方
6、法 材料 细胞人神经母细胞瘤细胞系(细胞株)(由北京中医药大学东直门医院实验室提供)。药 品 四 物 颗 粒(吉 泰 安,批 号:);盐 酸 多 奈 哌 齐 片(安 理 申,批 号:)。试剂与仪器人工合成 ()(万生昊天,型号:),高糖培养基(,)(,美国,货号:),澳洲胎牛血清(,美国,货号:),青 链霉素溶液(,美国,货号:),试剂盒(碧云天,货号:),检测试剂盒(日本同仁化工,日本,货号:),聚偏二氟乙烯膜(,)(,美国,货号:),细胞淋巴瘤 (,)抗体(,货号:),二抗(,美国,货号:),恒湿培养箱(,新加坡,型号:),离心机(,德国,型号:),倒置显微镜(,日本,型号:),多功能酶标
7、仪(,美国,型号:)。方法 四物汤活性成分筛选使用中药系统药理学数据库与分析平台(,)检索四物汤中白芍、熟地黄、当归、川芎四味中药的所有活性成分。筛选标准为口服生物利用度(,)和类药性(,),同时查阅文献,对四物汤的活性成分进行补充。四物汤“成分 靶点”网络构建 数据库获取四物汤中各个中药的活性成分对应的作用靶 点 信 息。通 过 数 据 库(:)得到四味中药的有效活性成分的标准 号,导入 数据库(:)进行靶点预测,选取 的作用靶点。整合 个数据库所收集到的所有靶点信息并进行去重。通过 数据库(:)查询标准化靶点蛋白名称及对应的人类基因名称,物种选择为“”。将活性成分和靶点导入 软件,构建药物
8、 活性成分 靶点网络。疾病靶点获取及关键靶点筛选在 数据库(:)和 数据库(:)中以“”为关键词进行检索,在 数据库检索结果中选择关联分数()的疾病靶点,对最终获得 个数据库中的疾病靶点进行整合并去重。最后通过 数据库(:)查询标准化靶点蛋白名称及对应的人类基因名称。通过微生信(:)绘制四物汤活性成分靶点和阿尔茨海默病靶点的韦恩图。蛋白质蛋白质相互作用(,)网络构建将四物汤与 的共同靶点导入 数据库(:),使用“”,物种选择“”,最低相 互 作 用 评 价 阈 值 选 择“()”,并隐藏网络中没有链接的节点,获得潜 ,在靶点的 网络。再将获得结果导入 软件进行拓扑学分析并构建核心靶点(值前 )
9、的 网络。基因本体(,)与京都基因和基因组百科全书(,)富集分析利用 (:)对获得的潜在靶点进行 富集分析和 通路富集分析,进一步说明四物汤对应的潜在靶点在基因功能和通路中的作用,导出富集分析结果并绘制 柱状图和 点图。分组与模型制备 干预 建立细胞损伤模型,分为对照组()、模型组()、四 物 颗 粒 组(四 物 颗 粒 )和 多 奈 哌 齐 组(多奈哌齐 )组。干预方法使用 培养基将四物颗粒与盐酸多奈哌齐片分别稀释为 和 ,细胞贴壁后更换为含四物颗粒或盐酸多奈哌齐 的培养基,干预 。检测指标与方法 活力检测取对数生长期的细胞按 孔接种于 孔板中,过夜贴壁后进行分组干预,后每孔加入 的 试剂,
10、放置于 恒温,恒湿的培养箱中避光孵育 ,使用酶标仪于 波长处读取每孔的吸光度(,)。蛋白质免疫印迹法检测细胞中裂解得到的匀浆,置于,离心 ,取上清,经 试剂盒定量。用 的凝胶电泳(,)分离蛋白,转移至 膜,使用快速封闭液封闭,然后在与特异性一抗孵育过夜:细胞淋巴瘤(,。随后使用含吐温 的 清洗次,次,然后与二抗()室温下孵育 ,然后免疫反应条带可视化,使用分析软件()进行分析。统计学方法采用 统计软件对研究数据进行统计分析,实验数据以均数 标准差(珋 )表示,组间比较使用单因素方差分析,方差齐性用采用 检验;方差不齐性使用 检验。以 为差异有统计学意义。结果 四物汤活性成分筛选借助 数据库和查
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