基于网络药理学及实验验证探讨喉咽清治疗咽炎的作用机制.pdf
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1、2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 基于网络药理学及实验验证探讨喉咽清治疗咽炎的作用机制张恒1,2,王玉凤1,2,唐纯玉3,4,张坚强5,王雄龙3,4,李丹5,刘实琪1,涂红英1,李顺祥1,欧阳文1,4,5(1.湖南中医药大学药学院 长沙 410208;2.湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室 长沙 410208;3.湖南时代阳光药业股份有限公司 永州 410116;4.湖南时代阳光博
2、士后科研流动站协作研发中心 永州 410116;5.浏阳市中医医院 浏阳 410300)摘要:目的运用网络药理学并结合动物实验探究喉咽清治疗咽炎的物质基础及作用机制。方法通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库检索喉咽清的化学成分,并通过文献检索补充潜在活性成分,再经TCMSP及SwissTargetPrediction数据库预测成分作用靶点,建立靶点数据;通过GeneCards数据库筛选出抗炎相关靶点;用Cytoscape 3.9.0软件构建“化合物-靶点(基因)”网络可视化关系图;采用STRING数据库对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析,使用Cytoscape 3.9
3、.0软件中的CytoNCA插件对STRING数据库导出的PPI网络进行degree值算法分析,将degree值排名前30的网络靶点作为喉咽清的抗炎核心靶点,并构建“核心靶点-活性成分”网络图;通过DAVID分析平台进行基因本体(GO)分析和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,探讨喉咽清抗炎的潜在生物过程及其通路;利用Autodock软件进行半柔性分子对接反向验证。在动物实验中,以15%的浓氨水诱导咽炎大鼠模型,经喉咽清灌胃处理后,ELISA法检测大鼠血清一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素1-beta(IL-1)的表达,HE染色观
4、察大鼠咽部组织病理学变化。结果从喉咽清中共筛选得到65个活性成分,关键靶点涉及PTGS2、AKT1、MAPK3、STAT3、IL-6、TNF、NFKBIA等。KEGG通路富集结果显示喉咽清主要作用于Pathways in cancer、Hepatitis B、TNF signaling pathway等信号通路。分子对接结果显示-蜕皮甾酮、齐墩果酸、山奈酚、竹节参皂苷IVa等核心化合物与关键靶点同时满足空间匹配与能量匹配。动物实验表明,与正常对照组相比,模型对照组大鼠咽部炎性改变明显,血清IL-6、IL-1水平升高;与模型组相比,地塞米松 5 mgkg-1组、喉咽清 1.34 gkg-1、2.
5、67 gkg-1组大鼠咽部炎症减轻,地塞米松 5 mgkg-1组、喉咽清1.34 gkg-1、2.67 gkg-1组血清IL-6含有量降低(P0.05)。结论喉咽清可能是通过调控肿瘤合成途径、乙型肝炎、肿瘤坏死因子等信号通路,对细胞代谢的多个过程产生影响,抑制炎症因子的表达,发挥抗炎作用。初步推测并验证了喉咽清治疗咽炎的主要靶蛋白与通路,为后续进一步验证喉咽清靶向抗炎提供新思路。关键词:喉咽清 网络药理学 咽炎 靶点 作用机制doi:10.11842/wst.20220228018 中图分类号:R285 文献标识码:A 收稿日期:2022-02-28 修回日期:2022-05-22 湖南省自然
6、科学基金委员会面上项目(2021JJ30500):基于NF-B与Nrf2双信号通路研究新冠防治方“喉咽清”的抗炎作用与物质基础,负责人:欧阳文;湖南省中医药管理局一般项目(2021060):基于NF-B与Nrf2双信号通路的新冠防治方“喉咽清”抗炎作用与物质基础研究,负责人:欧阳文;湖南省教育厅创业训练项目(湘教通 2021 197号):新冠防治方“喉咽清”的抗炎物质与作用机制研究,负责人:涂红英。通讯作者:欧阳文,博士,副教授,博士后,硕士研究生导师,主要研究方向:中药药效物质基础与作用机制研究;李顺祥,本刊编委,博士,二级教授,研究员,博士研究生导师,主要研究方向:中药药效物质基础与作用机
7、制研究。1714 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究咽炎(Pharyngitis)是咽部粘膜、粘膜下组织及其淋巴组织的炎症反应,包括急性咽炎与慢性咽炎1-2。近年来,随着社会的发展与环境的改变,咽炎的发病率不断呈上升的趋势,该病一年四季均可染病,无论是急性咽炎还是慢性咽炎,如果反复发作,对人体特别是肺部的伤害十分严重,不仅会影响患者的呼吸功能,而且大大降低了患者的生活质量。相比于西医通过使用单一的抗生素
8、、糖皮质激素等药物以达到治疗咽炎的目的,中医的治疗方法疗效更加显著,且不良反应相对较少、安全性更高3。因此,寻找开发出能对咽炎产生显著疗效的中药制剂,一直是社会医疗中的热点关注问题。喉咽清口服液(颗粒)是湖南时代阳光药业股份有限公司自主研制开发的国家级新药,由土牛膝、马兰草、车前草、天名精四味中药加水煎制而成,四味中药均属寒凉药、归肝经,且均有清热解毒的效果,四药合用,增其清热解毒之功,另有凉血利咽之效,临床常用于肺胃实热所致的咽部红肿、咽痛、口渴、发热、急性扁桃体炎、急性咽炎见上述证候者4,连续被2010、2015、2020版 中国药典 收录5。该制剂具有良好的研究前景,并且在2020年新型
9、冠状病毒肺炎(COVID-19)的治疗过程中被湖南省卫生健康委纳入 湖南省儿童新型冠状病毒感染临床诊断与治疗专家共识(试行第一版)6。大量研究表明,喉咽清在治疗咽炎方面具有良好的抗炎作用7-10,胡蓉等11对喉咽清颗粒治疗风热喉痹的临床疗效及安全性进行研究,并将其与连花清瘟颗粒的临床疗效进行比较,结果表明喉咽清颗粒治疗风热喉痹的安全性、有效性均高于连花清瘟颗粒。喉咽清因其在抗炎方面安全有效,在临床上已有多次药物联用研究,宁来忠12对喉咽清口服液联合利巴韦林气雾剂治疗儿童急性咽炎的临床疗效进行研究,结果显示两种药物联用后临床总治疗率升高,且无不良反应的增加。多次研究结果表明13-18,当其他药物
10、与喉咽清联用后,可在临床上获得更好的疗效并降低前者药物的毒副作用,喉咽清还可用于放射性化疗等治疗方式引起的口腔溃疡等炎症反应,均取得良好的临床反馈。但是,目前对喉咽清抗炎机制的研究报道相对较少。网络药理学融合多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容,具有整体性、系统性的特点,能揭示“药物-基因-靶点-疾病”之间相互作用的关系,与中药复方多成分、多靶点、多途径的特征相吻合,能够加速中药药效物质与作用机制的发现过程,改进药物研究策略19-20。因此,本研究通过网络药理学及动物实验对喉咽清抗炎机制进行研究,以期为其临床应用奠定理论基础。1 材料与方法 1.1喉咽清有效成分筛选通过传统中药
11、系统药理学数据库和分析平台(https:/old.tcmsp- TCMSP 数据库、Swiss 数据库(http:/www.swisstargetprediction.ch/)23查询喉咽清主要活性成分所对应的靶点,同时通过 Uniprot数据库(https:/www.uniprot.org/)24查询靶点对应的基因名,选择物种为“人类(Homo sapiens)”,建立数据集,将靶点蛋白名称对应Uniprot数据集统一转换为基因名。检索GeneCards在 线 数 据 库(https:/www.genecards.org/)25,选 择“antiinflammatory”为关键词,获得与抗炎
12、相关靶点的数据集。使用TBtools软件26中“Graphics Venn”功能,提取药物与疾病交集靶点作为喉咽清抗炎潜在作用靶点。1.3喉咽清PPI网络的构建将喉咽清抗炎的潜在作用靶点导入STRING在线数据库(STRING:functional protein association networks(string-db.org))获取 PPI网络,选择物种为“人类”,置信度设置为 0.400,使用 Cytoscape 3.9.027中 CytoNCA插件中的degree值算法筛选出得分前30的潜在核心靶点,将30个潜在核心靶点导入STRING数据库,选择物种为“人类”,置信度设置为0.9
13、00,得到喉咽清潜在核心靶点蛋白的PPI网络。1.4“药材-成分-靶点”网络构建与分析将“药 材-成 分”、“成 分-靶 点”信 息 导 入Cytoscape 3.9.0 绘制“药材-成分-靶点”网络图。药材、成分、靶点在网络图中用节点表示,两个节点间的相互作用用边表示。1715 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 1.5“核心靶点-活性成分”网络构建将筛选得到的核心靶点匹配相应的活性成分,
14、通过Cytoscape3.9.0绘制“核心靶点-活性成分”网络图。1.6喉咽清GO及KEGG通路富集分析通过DAVID Bioinformatics Resources 6.8在线分析平台28(DAVID Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis(ncifcrf.gov))对喉咽清核心靶点进行GO和KEGG富集分析。选取BP(生物学过程)、MF(分子功能)及KEGG富集通路前30个条目进行气泡图绘制。1.7喉咽清活性成分和核心靶点分子对接验证核心靶点蛋白的三维结构通过 PDB 数据库29(https:/www.rcsb.o
15、rg/)下载得到,活性成分的三维结构图通过 PubChem 在线数据库30(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载获得。通过Open Babel-2.4.1软件31将 活 性 成 分 的 三 维 结 构 统 一 成 PDB 格 式。在Autodock 4.2.6软件32中将准备的靶点蛋白与活性成分进行前处理,随后通过Autodocking将处理好的蛋白与小分子进行对接,使用Auto工具计算成分与靶蛋白的对接结合能,再通过Pymol程序33将对接结果可视化。1.8实验验证1.8.1实验动物25只SPF级大鼠,周龄6-8周,体质量(20020)g,雌雄各半,动物生产
16、许可证号:SCXK(湘)2019-0004,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。常规饲养于湖南中医药大学动物实验中心,自由饮食及进水。实验过程经湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查通过。1.8.2试剂喉咽清口服液,由湖南时代阳光药业股份有限公司提供,生产批号:20210716;大鼠白介素 6(IL-6)ELISA 试剂盒、大鼠白介素-1(IL-1)ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子(TNF-)ELISA试剂盒、大鼠血清一氧化氮(NO)ELISA试剂盒,货号:G0132W,购自北京四正柏生物科技有限公司。1.8.3仪器TGL-16.5M台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);SuPe
17、rMax 3100型多功能酶标仪(上海闪谱生物科技公司);梅特勒ME104E万分之一电子天平(上海子期实验设备有限公司)。1.8.4分组、造模及给药将25只大鼠在实验条件下适应性饲养1周后随机分为5组,每组5只。咽炎大鼠模型参照文献方法34建立,除正常对照组外,其余各组均在适应性喂养1周后在第1-3天对大鼠咽部涂抹15%氨水(反复涂抹3次,使咽部黏膜充血肿胀,形成急性炎症)。正常对照组以等量生理盐水进行涂抹。将氨水诱导的咽炎模型大鼠随机分为喉咽清高剂量治疗组(5只)、喉咽清低剂量治疗组(5只)、地塞米松治疗组(5只)及模型组(5只)。实验第4天开始每日1次灌胃治疗,给药剂量参考 药理实验方法学
18、 中人与动物体表面积折算等效比值表进行折算(大鼠比表面积/人体比表面积=6.6),喉咽清高剂量治疗组以2.67 gkg-1进行灌胃治疗,喉咽清低剂量治疗组以1.34 gkg-1进行灌胃治疗,地塞米松治疗组以5 mgkg-1进行灌胃治疗,连续灌胃5天。1.8.5行为研究和咽组织病理评估根据行为和身体评分标准,对喉咽清和地塞米松治疗后的氨诱导咽炎大鼠模型的饮食、活动、口腔抓痕、口腔毛发、咳嗽和唾液分泌变化进行行为学评分。根据咽炎病理评分标准,对各组大鼠黏膜增生、细胞浸润、血管扩张出血、腺体肥大改变进行咽组织病理评分。1.8.6标本采集及处理末次给药24 h后,大鼠腹主动脉取血后处死,分离血清,用
19、ELISA 法检测血清中 NO、TNF-、IL-6 及IL-1含量。取咽组织,用4%多聚甲醛固定液浸泡,标本脱水,石蜡包埋。切片后在显微镜下观察各组大鼠咽部组织情况并进行评估。1.8.7统计学方法采用SPSS 21.0软件对数据结果进行统计分析,计量结果以均值标准差(x s)表示。使用单因素方差分析对组间数据结果进行比较,P0.05表示具有统计学差异。2 结果 2.1喉咽清治疗咽炎的网络药理学分析2.1.1有效成分及靶点筛选经筛选得到喉咽清中潜在成分65个,其中土牛膝23个,车前草21个,马兰草15个,天名精13个。其中牛膝、马兰草共有成分1个,命名为A1;牛膝、车前草共有成分3个,分别命名为
20、B1、B2、B3;牛膝、车前草、马兰草共有成分1个,命名为C1;车前草、马兰草共有成分1个,命名为D1。喉咽清潜在活性成分筛选结果见表1,其中部分成分在TCMSP数据库中未收录,该部分数据结果见表2。1716 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究表1从喉咽清中筛选出的潜在成分及其参数MOL012461MOL012505MOL012537MOL012542MOL001454MOL001458MOL00264
21、3MOL002897MOL000358MOL003847MOL000422MOL004355MOL000785MOL000085MOL000098MOL008647MOL012524MOL000483MOL007799MOL001735MOL000006MOL000359MOL007796MOL004004MOL007783MOL000008MOL007795MOL013156MOL007816MOL002813MOL001668MOL002819MOL003202MOL000511MOL000415MOL002928MOL004368MOL005573MOL000359MOL000524MO
22、L004718MOL010584MOL010801MOL000508MOL007599MOL001500MOL005981MOL002722MOL00184228-norolean-17-en-3-olbidentatosidespinoside A-ecdysteroneberberinecoptisinedelta 7-stigmastenolepiberberine-sitosterolinophyllum Ekaempferolspinasterolpalmatine-daucosterol_qtquercetinmoupinamideN-trans-feruloylmethoxyty
23、ramineN-cis-feruloyltyraMine-sitosteryl palmitatedinatinluteolinsitosterolstigmasteryl palmitate6-OH-Luteolinmelampyrosideapigeninisoacteoside_qtpoliumosideplantasiosideaucubingeniposidic acidcatalpol8-epi-Loganic acidursolic acidrutinoroxylin ahyperingenkwanin-sitosteroldammara-20,24-dien-3beta-ol-
24、spinasteroldaucosterol-amyrinfriedelinfriedelanolloliolidecarabronevomifoliolpinoresinol35.9331.7641.7544.2336.8630.6737.4243.0936.9138.8141.8842.9864.636.9146.4386.717.27118.3530.9130.9736.1636.9138.0946.9357.523.061.5238.881.535.5619.595.074.4316.773.241.376.9437.1336.917.3742.982.7215.9329.1611.2
25、844.6622.6629.014.250.780.590.40.820.780.860.750.780.750.850.240.760.650.750.280.260.340.260.40.270.250.750.40.280.80.210.660.560.820.330.410.440.40.750.680.230.770.240.750.750.760.60.760.760.760.080.170.080.52牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝牛膝车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草车前草马兰草马兰草
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