基于网络药理学和细胞实验探讨栀子豉汤干预心肌梗死的作用.pdf
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1、基于网络药理学和细胞实验探讨栀子豉汤干预心肌梗死的作用马 慷,任 美,任素娟,周 瑞,宋忠兴,刘妍如,唐志书,陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心 秦药特色资源研究开发国家重点实验室(培育)陕西省创新药物研究中心,陕西 咸阳;中国中医科学院研究生院,北京 收稿日期:基金项目:中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设项目”();年咸阳市重大科技专项()作者简介:马 慷(),男,硕士,从事中药药理研究。:,:通信作者:周瑞(),女,博士,副教授,硕士生导师,从事中药药理作用机制研究。:(),:宋忠兴(),男,副主任药师,从事中药新产品研发与转化研究。:摘要:目的 基
2、于网络药理学、分子对接技术及体外细胞实验探究栀子豉汤干预心肌梗死()的潜在分子机制。方法 根据、和 等数据库以及相关文献,筛选栀子豉汤主要成分靶点和心肌梗死相关靶点。利用 数据库和 软件构建蛋白互作网络,拓扑分析筛选核心靶点,对其进行 和 富集分析并构建“药物成分靶点通路”网络。运用 进行关键成分与核心靶点的分子对接。通过 法、染色法、罗丹明 染色法和蛋白免疫印迹法验证栀子豉汤对 细胞的作用。结果筛选得到栀子豉汤中槲皮素、藏花酸、藏红花素等 种活性成分调控、等 个核心靶点,作用机制涉及信号转导过程、刺激反应和蛋白结合等基因功能以及肿瘤坏死因子、和 等信号通路。分子对接显示,栀子豉汤中重要的活性
3、成分槲皮素、青蒿素、黄豆苷和染料木素与 靶点紧密结合。细胞实验证实,栀子豉汤能够恢复 诱导的 细胞活力,升高线粒体膜电位,改善细胞氧化应激水平,以及调控 、和 蛋白表达。结论 通过网络药理学与体外细胞实验验证了栀子豉汤可能通过调控 信号通路,发挥保护心肌损伤的作用。关键词:栀子豉汤;心肌梗死;网络药理学;分子对接技术;信号通路中图分类号:;文献标志码:文章编号:():心肌梗死在国内外都有着较高的发病率和死亡率,且呈逐年上升的趋势。目前心肌梗死的治疗主要包括药物治疗、溶栓治疗和冠状动脉搭桥术等,虽然疗效显著,但在治疗的同时容易发生一些不可预测的并发症,包括出血、缺血再灌注损伤和冠状动脉再狭窄等。
4、近年来中药复方在预防心血管疾病中发挥着重要的作用,例如四君子汤能够降低梗塞大鼠心肌酶的释放和心肌缺血损伤;复方龙脉宁能改善大鼠急性心肌梗死的心肌损伤,降低大鼠血清中白介素 ()、白介素 ()等表达。栀子豉汤记载于 伤寒论,具有镇静催眠、抗氧化和调节内分泌的作用。处方中栀子可发挥泻火除烦,清热利湿功效;淡豆豉可发挥解表除烦,宣发郁热功效,常用于寒热,头痛,烦躁胸闷,虚烦不眠等。在 伤寒论第、条记载中,“发汗,若下之而烦热,胸中窒者,栀子豉汤主之。”“伤寒五六日,大下之后,身热不去,心中结痛者,未欲解也,栀子豉汤主之。”由此可见,栀子豉汤有可能发挥治疗心血管疾病的作用。因此,本研究拟采用网络药理学
5、与细胞实验方法,预测栀子豉汤预防心肌梗死的作用机制。材料 细胞 大鼠心肌细胞株 细胞,购自中国科学院上海细胞库。将 细胞复苏后于 培养液(含 胎牛血清、青链霉素溶液)中,置于 、培养箱中培养,观察细胞形态,每 更换 次培养液,当生长密度达到 左右时,进行传代,取对数生长期的细胞进行实验。药物与试剂栀子(批号)、淡豆豉(批号),均购自陕西兴盛德药业有限责任公司,药材由陕西中医药大学刘世军教授鉴定为茜草科植物栀子 的干燥成熟果实,豆科植物大豆的成熟种子的发酵加工品。磷酸盐缓冲液(,批号,武汉博士德生物工程有限公司);胎牛血清()、高糖 培养基(批号、,美国 公司);裂解液、染色、(批号、,上海碧云
6、天生物技术有限公司);二甲基亚砜(,批号,美国 公司);超氧化物歧化酶()试剂盒、丙二醛()试剂盒、乳酸脱氢酶()试剂盒 年 月第 卷 第 期中 成 药 (批号、,南京建成生物工程研究所);罗丹明 检测试剂盒(批号,江苏凯基生物技术股份有限公司);、鼠单克隆抗体(批号、,美国 公司);鼠单克隆抗体、羊抗鼠二抗(批号、,武汉三鹰生物技术有限公司);鼠单克隆抗体(批号,美国 公司)。仪器 型全波长酶标仪、型细胞培养箱、型微量冷冻离心机、型 超 低 温 冰 箱(美 国 公司);型配气式厌氧细胞培养箱(无锡菩禾生物医药技术有限公司);型洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司);型倒置显微镜(日本
7、奥林巴斯公司);电泳分析仪、型伯乐凝胶成像仪(美国 公司);型干燥 喷 雾 机(上 海 雅 程 仪 器 设 备 有 限 公 司);型电子天平(瑞士 公司)。方法 网络药理学 药物活性成分筛选 检索中医药整合药理学网络计算研究平台(,:)、中医药百科全书(,:)数据库,并查阅相关文献,获取药物成分信息。药 物 靶 点 筛 选 运 用、和(:)数据库,搜集栀子、淡豆豉活性成分靶点。疾病相关靶点筛选通过 (:)、(:)、(:)和(:)数 据 库,以“”为关键词搜索心肌梗死有关靶点,将搜索得到的疾病靶点与药物成分靶点取交集。网 络 构 建 及、富 集 分 析 运 用 数据库(:),将成分疾病的共有靶点
8、进行 网络构建;通过京都基因与基因组百科全书(,)进行关键靶点的代谢通路富集分析。使用在线作图网站微生信将 分析结果以柱状图输出,通路富集结果以气泡图输出。“药物成分靶点通路”网络构建分析筛选栀子豉汤成分靶点,富集得到心肌梗死的主要信号通路以及各通路对应的相关靶点,运用 软件构建“药物成分靶点通路”网络。利用 功能进行网络拓扑学分析,根据 值分析主要活性成分与核心靶点。分子对接虚拟筛选将“药物成分靶点通路”网络中度值排名靠前的 个化学成分,结合、筛选出来的 靶点进行分子对接。从 数据库下载上述有效成分的 格式文件,从 (:)数据库中获得核心蛋白的 结构,使用 进行分子对接,并将结合能最低的模型
9、运用 软件进行可视化。细胞实验 栀子豉汤提取物制备取栀子 和淡豆豉,加 倍量水,水煎煮提取 次,每次 ,过滤,合并滤液,离心,得水提液;水提液经适当浓缩后,采用喷雾干燥技术制备成干膏粉(进风口温度 ,进样速度 )。实验时用 将栀子豉汤干膏粉溶解,经 水膜过滤后备用。细胞分组、造模及给药预先进行不同时间的缺氧 复氧()处理,以确定合适的造模条件。细胞分为对照组、模型组和栀子豉汤低、中、高剂量组(、),栀子豉汤各剂量组在 、正常培养条件下加入栀子豉汤提取物预保护 ,对照组和模型组不做任何处理。然后将模型组与栀子豉汤组在 、培养箱中缺氧 ,之后在正常培养条件下复氧 ;对照组细胞在正常培养条件下培养相
10、同时间。细胞活力检测 取对数生长期 细胞接种于 孔板,每孔约 个细胞,每组设置 个复孔,按“”项下方法分组、造模及给药,每孔加入 溶液,孵育 ,弃培养基,加入 二甲基亚砜充分溶解结晶,通过酶标仪在 波长处测定光密度()。染色观察细胞形态 细胞以每孔 个的密度接种在 孔板中,按“”项下方法分组、造模及给药,细胞使用 在 环境中避光染色 ,于荧光显微镜下观察细胞形态。线粒体膜电位检测 细胞以每孔 个的密度接种在 孔板中,按“”项下方法分组、造模及给药,细胞使用 罗丹明 在 中避光孵育 ,于荧光显微镜下分析线粒体膜电位变化。、活性和 水平检测 细胞以每孔 个的密度接种在 孔板中,按“”项下方法分组、
11、造模及给药,收集各组细胞,加入 裂解液,冰上裂解 ,离心取上清液,测定蛋白浓度,根据、和 试剂盒说明书检测细胞、活性和 水平。蛋白免疫印迹法检测、蛋白表达 细胞以每孔 个的密度接种在 孔板中,按“”项下方法分组、造模及给药,收集各组细胞,离心 ,细胞沉淀加入 裂解液于冰上裂解,离心取上清液,使用 法对蛋白质进行定量。蛋白经电泳、转膜、封闭、孵育一抗二抗后,法进行曝光,用增强化学检测系统检测各蛋白表达。年 月第 卷 第 期中 成 药 统计学分析通过 软件进行处理,数据以()表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 检验。为差异具有统计学意义。结果 网络药理学 栀子豉汤活性成分与靶点筛
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